高压结合热处理对猪肉中过氧化氢酶活性的影响

孙　娟，黄业传，王艳荣

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010）

高压结合热处理对猪肉中过氧化氢酶活性的影响

孙娟，黄业传*，王艳荣

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010）

为研究不同压力（200～600 MPa）结合不同热处理温度（30～50℃）和处理时间（10～30 min）后对猪肉中过氧化氢酶（CAT）活性的影响，以猪背最长肌为实验原料，在单因素实验的基础上采用响应面法分析。实验结果表明：压力和温度是影响CAT活性的最显著因素，压力和温度及压力和保压时间对CAT活性的影响均有极显著交互作用（p＜0.01），且影响CAT活性的临界温度随压力的升高呈线性下降趋势，影响CAT活性的临界保压时间随压力的升高呈线性上升趋势。CAT活性最高的处理条件是600 MPa、30℃、10 min，其活性为1.679 U/mg prot。

高压，热处理，猪肉，过氧化氢酶活性

上世纪初日本发明了现代意义上的第一台高压设备并应用于果酱等食品的灭菌处理上，标志着高压技术应用于食品加工的开端［1］。超高压能破坏蛋白质的一级结构，使氢键、二硫键和离子键等非共价键发生断裂，改变蛋白质性质，达到抑制或杀灭食品中有害微生物和酶的目的，能最大限度的延长食品保质期。高压还能改善食品本身的特性，如营养、风味、嫩度、凝胶性［2］等。与传统的热处理方式相比，高压处理则是一种冷杀菌技术，对食品的营养和感官品质破坏更小［3］，能很好地保持食物的色、香、味和营养成分，还能改善食物的某些性质，如改变肉的嫩度［4-5］、影响肉的色泽［6-10］等。但高压处理也会产生对食品品质不利的因素，如在一定压力下处理肉制品能加快肉中肌内脂肪氧化，从而导致肉制品品质败坏［11］，并且导致脂肪氧化［12-13］产生游离自由基［14］，影响肉质品安全性，对人体健康造成一定的威胁。

动物肌肉中的脂肪氧化酶、脂肪酶等能加速脂肪氧化或降解，产生的自由基能够促使疾病的发生和机体的衰老［15-16］，而抗氧化酶可以清除自由基，能够抑制或者减缓脂肪氧化，起到维持肉品品质的作用。过氧化氢酶（CAT）广泛存在于需氧微生物及动植物的主要组织中，它的主要作用就是催化过氧化氢分解为水与分子氧，减少过氧化氢对机体的损害，起到保护细胞的作用［17］。超高压对酶的作用效果一方面是较低的压力能激活一些酶，使酶的活性增加；另一方面较高压力可导致酶完全失活。一般对高压结合低温处理杀灭肉制品中一些耐压微生物的研究较多［18-22］，但有关高压结合热处理对肉品中过氧化氢酶活性影响的报道却很少［23］，高压结合热处理对CAT活性是否有显著影响，有必要进行研究。

本研究以猪肉背最长肌中CAT活性为测定指标，研究压力（200～600 MPa）结合温度（30～50℃）处理10～30 min对猪肉中CAT活性的影响，为高压结合热处理在肉制品中的进一步应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

土猪购于四川绵阳市青义镇青义市场，6～8个月月龄，体重80～110 kg，早上宰杀，取新鲜背最长肌；氯化钠四川成都市联合化工试剂研究所，分析纯；CAT可见光试剂盒江苏南京建成生物工程研究所。

HPP.L2-800/1型食品高压设备天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司；DZ400-DZ（2L）型真空封装机四川成都瑞昌仪器制造有限公司；TDL-60B型低速台式离心机上海安亭科学仪器厂；FSH-2A型可调高速匀浆器金坛市金玻实验仪器厂；HH4型数显恒温水浴锅江苏常州澳华仪器有限公司；UV1000型单光束紫外可见分光光度计上海天美科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1材料选取买市售同一头猪的新鲜背最长肌约4 kg，快速运回实验室，去掉表面可见脂肪、筋膜及结缔组织，切成长宽高约1 cm左右的小块，迅速混合均匀后按每份10 g左右分装于透明聚乙烯包装中，实验室条件下利用真空封装机封装，封装后的样品马上进行高压处理或冷冻备用。

将真空包装且解冻24 h后的猪肉样品按照设定的压力、温度和时间进行处理，经处理的样品立即置于4℃冷藏待测，每组处理设置3个平行实验。超高压设备的工作参数为：压力范围0～800 MPa，升压速度约为50 MPa/s，卸压速度约为100 MPa/s。葵二酸二辛酯作为高压处理的传压介质。

1.2.2CAT活性测定取3 g左右高压处理后的猪肉组织，根据预实验所确定的最佳取样浓度10%制备上清液，根据过氧化氢酶试剂盒说明，在405 nm处测定吸光值，再通过吸光值及蛋白质含量计算出CAT的活力。根据试剂盒说明，将CAT活力定义为每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H2O2为1个酶活性单位（U）。

1.2.3单因素实验设计根据实验室及设备能达到的实验条件对单因素实验水平行进设计。

1.2.3.1温度对CAT活性影响的研究在预备实验的基础上，750 MPa，10min以及20、30、40、45、50、55、60℃处理猪肉组织后立即测酶活。

1.2.3.2压力对CAT活性影响的研究用200、400、500、600、650、700、750 MPa在50℃条件下处理猪肉组织10 min后立即测定CAT活性。

1.2.3.3时间对CAT活性影响的研究在650 MPa、50℃条件下将猪肉组织处理0、5、10、15、20、25、30 min后立即测CAT活性。

1.2.4响应曲面设计在单因素实验的基础上以压力、温度、保压时间为实验自变量，CAT活性为响应值，运用Design-Expert 8.0.6.1中的Central Composite Design响应曲面设计程序进行响应面设计［24］，设计得到实验组数为20，其中包括6个0水平点，响应面实验因素水平见表1。

表1　响应面实验因素水平表Table 1　Factors and levels of RSM experiment

1.3统计方法

所有酶活测定结果利用统计软件SPSS 13.0计算其平均值和标准误，响应面实验结果利用最小二乘法进行二次多项式回归统计分析，其基本模型如下：

Y=β0+∑βiXi+∑βiiXii2+∑βijXiXj

式中：β0，βi，βii，βij是回归系数；Xi，Xj代表不同自变量；Y代表响应变量CAT的活性。

2　结果与分析

2.1温度对CAT活性的影响

不同温度对CAT活性的影响结果如图1所示。

图1　温度对CAT活性的影响Fig.1　Effect of temperature on CAT activity

从图1中可以看出用超高压750 MPa、处理10 min的条件下CAT活性随着温度的升高先降低后升高，出现了激活现象，激活临界值约为50℃左右；在20～50℃范围内，随温度升高CAT活性基本呈直线降低趋势；从50℃以后随着温度的升高CAT的活性又开始急剧地升高（p＜0.01）。出现这种现象的原因可能是在超高压750 MPa处理猪肉时，猪肉组织结构发生了极大破坏，使得部分CAT活性有所降低，当CAT全部暴露出后在适宜的温度范围CAT活性又增加。有关高压结合热处理对CAT活性影响的研究几乎没有，所以无法对比其他学者的研究结果。温度对CAT活性可能有激活现象，激活机理有待进一步研究。酶的本质是蛋白质，温度对酶活性的影响主要包括两方面：一方面随着温度的升高，酶的活性逐渐增大，因为升高温度能够激活酶的催化活性，使酶的活性升高；另一方面继续升高温度酶会变性失活，使得酶的活性逐渐降低。

2.2压力对CAT活性的影响

不同压力对CAT活性的影响情况如图2所示。

图2　压力对CAT活性的影响Fig.2　Effect of pressure on CAT activity

由图2可以看出50℃、10 min处理条件下，随着压力的增大，CAT活性呈线性降低趋势，700 MPa时CAT活性降到最低，但没有完全失活。由图1的结果可知50℃时CAT活性最低，当处理压力由200 MPa增加至700 MPa时，CAT结构受到压力的不可逆破坏，其活性逐渐降低。700 MPa以上处理CAT几乎全部失活。很多有关高压的研究是基于对肉制品感官性状和脂肪氧化的研究，对CAT活性的研究几乎没有，如Sato等研究认为，不同形式的处理过程如绞碎、加热、高压等都会引起肉类肌纤维膜系统的破坏，将导致易氧化的脂类成分曝露于空气中，与氧气充分结合，从而加速了脂肪氧化［25］。

有研究报道高压处理会影响抗氧化酶的活性，如Serra发现猪肉原料600 MPa高压处理后进行火腿加工，抗氧化酶的活性会降低，但成品火腿中仍能检测到较高的酶活［25］；Clariana发现400 MPa压力处理火腿时超氧化物歧化酶的活性会增加，而600 MPa对火腿中抗氧化酶活性影响不大［26］。

2.3时间对CAT活性的影响

图3显示不同保压时间对CAT活性的影响情况。

由图3可知，650 MPa、50℃处理条件下，在0～10 min保压时间之内，CAT活性随着保压时间的增加呈先增强后降低趋势。因为在50℃温度处理下随着时间的增加CAT活性逐渐增加，同时高压条件破坏了猪肉的结构组织，细胞外CAT活性降低；10 min后，随着保压时间的继续增加，压力破坏了组织的细胞结构，使得胞内的CAT充分释放出来，CAT活性随即增加，其最高活性低于10 min前的最高活性但没有完全失活，所以其活性呈先升高后趋于稳定的趋势。Chenh研究发现原料肉中过氧化氢酶活性被抑制后，贮藏期间脂肪氧化明显增加［27］。

图3　保压时间对CAT活性的影响Fig.3　Effect of holding time on CAT activity

2.4响应面实验结果

2.4.1建立回归模型及显著性分析响应面实验方案及实验结果见表2。

表2　响应面方案及响应值Table 2　Program of RSM and response value

利用Design-Expert 8.0.6.1软件，对表2中的酶活数据进行分析，可得到关于CAT活性（Y）对压力、温度以及保压时间的二次多项回归方程，其表达式如下：

Y=-2.290+6.986×10-3A+0.129B+0.020C-1.514× 10-4AB-8.306×10-5AC-1.713×10-4BC-2.837×10-7A2-1.149×10-3B2+3.532×10-3C2

回归模型方程的方差分析结果见表3。

由表3响应曲面二次回归模型方差分析可知，本回归模型的显著性（F检验）检验结果极显著（p＜0.01），失拟性检验结果不显著（p＞0.05），决定系数（R2）和校正决定系数（R2Adj）分别为0.9792和0.9415，信噪比（Adeq Precision）为24.221，大于临界值4，这些结果证明本回归模型拟合效果较好、可靠性高，可充分地反映各变量之间的关系，能够进一步用于分析压力、温度以及保压时间对CAT活性的交互作用以及对CAT活性进行预测。

回归模型中各因素对CAT活性影响的显著性情况由表3可知：一次项A（压力）、B（温度）对CAT活性的影响都是极显著（p＜0.01）的，C（保压时间）对CAT活性的影响是显著的（p＜0.05）。而所有二次项中只有因素B2对CAT活性的影响是极显著的（p＜0.01），因素A2和因素C2对CAT活性的影响不显著。交互项AB与AC对CAT活性有极显著影响（p＜0.01），但BC的交互作用对CAT活性影响不显著。

响应曲面实验中评价两个实验因素对响应变量交互作用的方法主要是根据回归模型绘制响应曲面，通过它们的形状可以反映出两实验因素交互作用的显著情况［28］。

表3　响应曲面二次回归模型方差分析结果Table 3　ANOVA results for response surface quadratic model

2.4.2压力和温度对CAT活性的交互作用图4显示了固定保压时间C为20 min时，压力和温度对CAT活性的交互影响情况。

从图4可以看出压力和温度对CAT活性的影响具有明显的交互作用。时间固定在20 min，处理温度不变时，CAT活性随压力的增加而减小。处理压力不变时，随着温度的升高，CAT活性先增大后减小，因此存在温度临界值。当处理压力为200 MPa时，温度的临界值在40℃左右；当处理压力增加到280 MPa时，温度临界值在35℃左右；压力继续增加到360 MPa时，温度临界值约为30℃，说明升高处理压力能减小使CAT活性值变化的临界温度。

2.4.3压力和时间对CAT活性的交互作用图5显示了固定温度时压力和保压时间对CAT活性具有明显的交互作用。

图4　压力和温度对CAT活性交互影响的响应曲面Fig.4　Response surface of the interactive effect of pressure and temperature on CAT activity

图5　压力和时间对CAT活性交互影响的响应曲面Fig.5　Response surface of the interactive effect of pressure and time on CAT activity

温度固定在40℃，保压时间不变时，CAT活性随压力的增加而减小，这与单因素实验结果一致。当处理压力不变时，随着保压时间的延长，CAT活性先减小后增大，这与保压时间对CAT活性影响的实验结果基本一致，因此存在时间临界值。当处理压力为280 MPa时，处理时间临界值约为15 min；当处理压力增加到360 MPa时，时间临界值是23 min左右；压力继续增加到440 MPa时，时间临界值约在30 min，说明升高处理压力能增加使CAT活性值变化的临界保压时间。

为了得到高压结合热处理猪肉过程中CAT活性最佳的处理条件，对模型的二次多项回归方程求一阶偏导数并令其等于零，求解得到CAT活性最佳的处理条件为600 MPa，30℃，10 min，代入回归方程得到此处理条件下CAT的理论活性为1.914 U/mg prot。根据响应面优化后的高压结合热处理条件600 MPa，30℃，10 min进行3次重复实验测猪肉中CAT平均酶活为1.679 U/mg prot，与理论酶活值相比低了0.235 U/mg prot，说明利用响应面法优化得到高压结合热处理猪肉中过氧化氢酶活性的条件参数比较准确，具有一定的实用参考意义。

3　结论

在高压结合热处理猪肉过程中，压力和温度、压力和保压时间对CAT活性的影响有极显著（p＜0.01）交互作用。压力和保压时间一定的情况下，CAT活性随着温度的升高先降低后增加；温度和保压时间一定的情况下，CAT活性随着压力的升高而减小；温度和压力一定的情况下，CAT活性随着保压时间的延长呈波动趋势，先减小再增大后趋于稳定。由响应面得到高压结合热处理猪肉的最优参数是600 MPa，30℃，10 min，最优参数下的酶活为1.679 U/mg prot。由于在肉制品的高压处理过程中，多种处理因素同时起作用，因此研究它们的交互作用对高压结合热处理猪肉组织后CAT的活性的影响及酶活性的变化规律有着非常重要的指导意义，也为进一步探究猪肉的脂肪氧化与抗氧化酶活性的变化规律及两者的关系奠定一定的理论基础。

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Effect of high pressure combined thermal treatment on catalase activity of pork

SUN Juan，HUANG Ye-chuan*，WANG Yan-rong
（College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

In order to study the effect of different test conditions（200～600 MPa，10～30 min and 30～50℃）on the catalase（CAT）activity of pork.Use longissimus muscle as experimental materials and a response surface method（RSM）was applied on the basis of the analysis of the single factor experimental results.The results of RSM showed that pressure and temperature were the most significant factors on the CAT activity.Pressure and temperature as well as pressure and holding time had significant（p＜0.01）interactive on CAT activity，while the critical temperatures influencing the activity of CAT linearly decreased with pressure increasing and the critical holding time influencing the activity of CAT linearly increased with pressure increasing.The highest CAT activity processing conditions was 600 MPa，30℃，10 min，and its activity was 1.679U/mg prot.

high pressure；thermal treatment；pork；catalase activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0208-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.034

2014-12-03

孙娟（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：化学工程，E-mail：631160547@qq.com。

黄业传（1975-），男，博士，副教授，研究方向：肉制品加工与酶工程，E-mail：hyc2005@sina.com。

国家自然科学基金资助项目（31271892）；西南科技大学博士基金（12zx7110）。