金属离子对蛹虫草液体培养产胞外虫草素产量的影响

周思静，刘桂君，王　平，尚宏忠，顾海科，杨素玲，孟佑婷，郑　洁

（北京市辐射中心，北京100015）

金属离子对蛹虫草液体培养产胞外虫草素产量的影响

周思静，刘桂君*，王平，尚宏忠，顾海科，杨素玲，孟佑婷，郑洁

（北京市辐射中心，北京100015）

主要研究不同金属离子对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量及菌丝体生物量的影响。将含有Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ca2+、Co2+及I-的化合物添加到蛹虫草液体培养基中，选择出有利于胞外虫草素产量及菌丝体生物量增加的金属离子，确定其最佳添加浓度。实验结果表明：添加Mn2+、Ca2+、Mg2+能够显著（p＜0.05）提高蛹虫草液体培养胞外虫草素产量及菌丝体生物量，其最适浓度分别为Mn2+0.05 g/L、Ca2+0.6 g/L、Mg2+1.0 g/L。

蛹虫草，液体培养，胞外虫草素，金属离子，菌丝体干重

蛹虫草（Cordyceps militaris）又称北冬虫夏草、北虫草，分类学上属于子囊菌门（Ascomycota），粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座菌亚纲（Hypocreomycetidae），肉座菌目（Hypocreales），虫草菌科（Cordycipitaceae），虫草属（Cordyceps）［1］。蛹虫草是我国传统的食药用真菌，富含多种生物活性物质，主要包括虫草素、虫草多糖、虫草酸等，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血压、降血脂等生物活性［2］。

虫草素（Cordycepin）作为蛹虫草重要的生物活性成分，其化学结构为3′-脱氧腺苷，是由Cunningham［3］首次从蛹虫草中发现的。由于虫草素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等功效，市场需求越来越大，价格十分昂贵，国际市场上虫草素纯品的售价约高达2500美元/g［4］。目前，虫草素的化学合成存在诸多弊端，虫草素获得主要还是从蛹虫草中提取而来，蛹虫草固体培养生长周期长、生产成本高，远不能满足市场的需要，而液体培养由于生产周期短、条件容易控制、虫草素易于提取且产量较稳定，是目前获取虫草素较为有效的培养方法。因此，众多学者针对如何提高蛹虫草液体培养虫草素的含量进行了大量的研究，如通过菌株的选育［5］、培养条件的优化［6］、前体物质的添加［7］等。虫草素产量的高低从本质上取决于蛹虫草体内的虫草素合成代谢，而代谢调控主要受其关键酶的影响，金属离子作为多种酶的辅助因子或络合中心，协助并催化代谢途径中的各种生物反应。基于此，本文主要探讨在蛹虫草液体培养过程中添加不同种类及不同浓度的金属离子对其胞外虫草素产量及菌丝体生物量的影响，从而为有目的、有针对性的促进蛹虫草液体培养过程中虫草素的高效合成提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

蛹虫草（Cordycepes militaris）菌株编号为CM3-3，由北京市辐射中心微生物实验室保存；斜面培养基（PDA培养基） 土豆汁（马铃薯200 g煮沸过滤蒸馏水定容至1 L），葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH自然，121℃灭菌30 min；种子培养基葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH自然，121℃灭菌30 min；液体发酵基础培养基葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然，121℃灭菌30 min；虫草素标准品Sigma公司，HPLC级；甲醇CNW公司，HPLC级；蛋白胨北京双旋微生物培养基厂，生物纯级；葡萄糖、KH2PO4、FeSO4、FeCl3、ZnSO4、KI、CaCl2、MgSO4、MnSO4、Co（NO3）2、CuSO4国药集团北京化学试剂公司，分析纯。

1260型高效液相色谱仪配有DAD检测器，美国安捷伦仪器公司；5424型高速离心机德国Eppendorf公司；RC6+型大容量高速冷冻离心机美国Thermo公司；ZHWY-2112B双层恒温摇床上海智诚分析仪器制造有限公司；电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；分析天平德国赛多利斯公司。

1.2实验方法

1.2.1蛹虫草菌株的活化将蛹虫草菌株转接于PDA平板培养基上，恒温培养箱（25±1）℃活化培养14 d。

1.2.2种子液的制备在无菌条件下，将10块直径大小为0.5 cm的接种块接入装有500 mL种子培养基的1000 mL三角瓶中，180 r/min、（25±1）℃恒温振荡培养5 d，作为种子液备用。

1.2.3液体培养液体培养实验均采用250 mL三角瓶摇瓶培养，培养基装液量为100 mL，接种量为5%，在180 r/min、（25±1）℃恒温振荡培养7 d，得到蛹虫草发酵液和菌丝体混合物，简称菌悬液，待测。

1.2.4不同种类金属离子对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量及菌丝体生物量的影响实验本实验在液体基础培养基中分别添加0.1 g/L FeSO4、FeCl3、ZnSO4、KI、MnSO4、Co（NO3）2、CuSO4和0.5 g/L CaCl2、MgSO4，空白对照组为不添加金属离子的液体基础培养基，每组设3个重复，按1.2.3方法进行液体培养后，测定胞外虫草素产量及菌丝体生物量。

1.2.5不同浓度的金属离子对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量及菌丝体生物量的影响实验考察不同浓度的MnSO4、CaCl2和MgSO4对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量及菌丝体生物量的影响，其中MnSO4添加浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 g/L，CaCl2添加浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 g/L，MgSO4添加浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L，空白对照组为不添加金属离子的液体基础培养基，每组设3个重复，按1.2.3方法进行液体培养后，测定胞外虫草素产量及菌丝体生物量。

1.2.6虫草素含量的测定方法虫草素标准曲线的制作：分别取稀释度为20、40、60、80、100 μg/mL虫草素标准液，采用高效液相色谱（HPLC）法测定，测定条件为：DAD检测器，色谱柱为Eclipse XDB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；检测波长为260 nm；柱温为25℃；流动相为甲醇∶水（V/V为15∶85）；流速为1 mL/min，进样量为10 μL。根据虫草素浓度与峰面积响应值之间关系制作标准曲线。

样品的测定：取1.2 mL蛹虫草菌悬液于1.5 mL的离心管中，6500 r/min离心3 min，用一次性注射器吸取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液进行HPLC测定。

1.2.7菌丝体生物量的测定方法菌丝体生物量采用菌丝体干重得率表示法，将菌悬液在6500 r/min离心5 min，弃清液，离心管底部为菌丝体，将三角瓶和离心管用蒸馏水反复冲洗3次，按上述方法进行离心，合并菌丝体，置于60℃烘箱中烘干至恒重，称其重量计算菌丝体干重，菌丝体干重得率（g/L）=干菌丝体重量/发酵液体积。

1.2.8数据处理各实验组均重复3次，数据采用DPS 7.05软件进行分析，应用Origin 8.0作图。

2　结果与分析

2.1不同种类金属离子对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量和菌丝体生物量的影响

不同种类金属离子对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量和菌丝体生物量的影响各不相同，金属离子种类与胞外虫草素产量之间的关系如图1所示，金属离子种类与菌丝体生物量之间关系如图2所示。

图1　不同种类金属离子对蛹虫草液体培养产胞外虫草素产量的影响Fig.1　Effect of different metal ions on extracellular cordycepin production in submerged fermentation of C.militaris

由图1可知金属离子Mn2+、Ca2+、Mg2+及I-可以显著（p＜0.05）提高蛹虫草液体培养胞外虫草素含量，对胞外虫草素产量的增加效果从高到低依次为Mn2+＞Ca2+＞Mg2+＞I-。其中Mn2+对胞外虫草素产量的增加最为显著（p＜0.05），这与GU等［8］的报道相一致。与空白对照组相比，Fe3+、Zn2+使胞外虫草素含量降低，但影响并不显著，Zn2+降低虫草素产量与左言美［9］报道相一致，推测可能是由于其减少虫草素合成前体物质腺苷的含量，或Zn2+的加入使得某些被刺激的酶和基因通过转录因子影响了虫草素的合成。Fe2+、Co2+、Cu2+对蛹虫草液体培养虫草素合成具有抑制作用，其中Fe2+对胞外虫草素产量的抑制作用与FAN等［10］认为Fe2+能显著性提高蛹虫草液体摇瓶培养的虫草素含量的结论不一致，这可能是因为所选用蛹虫草菌株、培养条件等不同而引起的。Co2+、Cu2+对蛹虫草液体培养胞外虫草素合成具有抑制作用，此前未见相关报道。

图2　不同种类金属离子对蛹虫草液体培养菌丝体干重的影响Fig.2　Effect of different metal ions on dry cell weight in submerged cultivation of C.militaris

由图2可知金属离子Co2+、Zn2+、Mg2+可增加蛹虫草菌丝体的生物量，其Co2+对其菌丝体生物量的增加作用最为显著（p＜0.05）；而添加Fe2+、Fe3+、I-的蛹虫草菌丝体生物量降低，这可能是由于这些金属离子的加入抑制了细胞的生长；Cu2+、Mn2+、Ca2+对蛹虫草菌丝体生物量无显著性影响。

2.2不同浓度金属离子对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量和菌丝体生物量的影响

金属离子的缺失和过量均会对细胞的生长和代谢物的合成产生重要影响。因此，选取对蛹虫草液体培养胞外虫草素含量具有显著增加作用且对菌丝体生物量积累无抑制作用的金属离子Mn2+、Ca2+和Mg2+，研究不同浓度金属离子对其胞外虫草素积累及菌丝体生物量的影响。

2.2.1不同浓度Mn2+对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量和菌丝体生物量的影响由图3可知，与空白对照相比，低浓度Mn2+有利于胞外虫草素的积累，当Mn2+浓度为0.01～0.75 g/L时，胞外虫草素产量增加显著（p＜0.05），当Mn2+浓度小于0.05 g/L时，随着浓度的增加，胞外虫草素含量增加十分明显，在Mn2+浓度为0.05 g/L时，胞外虫草素的产量达到最高，为（189± 9.45）mg/L（为对照组的5.8倍）。大于0.05 g/L时，随着浓度的增大，胞外虫草素的产量增加量逐渐降低，当浓度为1.0 g/L时，与空白对照组几乎相同。不同浓度Mn2+对菌丝体干重的影响发现，在本实验的浓度范围内，菌丝体干重虽有所降低，但变化较小。

左言美等［11］报道高浓度（0～100 g/L）Mn2+胁迫可提高液体培养中菌丝体的虫草素含量，但当Mn2+的质量浓度过大时会显著的降低菌丝体生物量，且对两株不同蛹虫草菌株而言，其适合虫草素含量增加的最适浓度不同。本研究发现对其胞外虫草素的含量而言，Mn2+也可显著性提高胞外虫草素含量，但其浓度远远低于左言美等报道适合菌丝体中虫草素含量增加的Mn2+浓度，分析原因可能是由于本实验所选取的研究对象为液体培养胞外虫草素产量，而左言美等所选用的为菌丝体中虫草素产量，此外所选取的蛹虫草菌株不同、培养条件的差异等都有可能对此产生影响。对于Mn2+可提高蛹虫草中虫草素产量的原因是Mn2+能够促进蛹虫草菌丝体生长和一些核苷类物质（尿苷、鸟苷、腺苷）的合成［8］，此外，WANG等研究认为Mn2+也可促进蛹虫草中抗氧化酶的产生［12］。

图3　不同浓度MnSO4对蛹虫草液体培养过程中胞外虫草素含量及菌丝体干重的影响Fig.3　Effect of different MnSO4concentration on extracellular cordycepin production and DW in submerged cultivation of C.militaris

图4　不同浓度CaCl2对蛹虫草液体培养过程中胞外虫草素含量及菌丝体干重的影响Fig.4　Effect of different CaCl2concentration on extracellular cordycepin production and DW in submerged cultivation of C.militaris

2.2.2不同浓度的Ca2+对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量和菌丝体生物量的影响由图4可以看出，随着Ca2+浓度升高，胞外虫草素含量显著（p＜0.05）增加，当浓度达到0.6 g/L时，胞外虫草素产量达到最高，为（153±23.56）mg/L（为对照组的4.7倍），此后随着Ca2+浓度的上升，胞外虫草素的产量增加略有下降，但下降不显著（p＞0.05）。对蛹虫草菌丝体而言，菌丝体的生物量随Ca2+浓度的变化，其菌丝体干重变化并不明显，菌丝体干重均在（11.8±0.35）～（13.3±0.35）g/L之间。结合以上所述Ca2+对虫草素和菌丝体生物量积累的综合影响，本实验认为最适的Ca2+添加量应为0.6 g/L。目前对于Ca2+可提高胞外虫草素产量并有利于菌丝体积累的文献较少，且没有一致性的结论，有研究认为Ca2+通过改变细胞的渗透压从而可促进真菌菌丝体的生长［13］，也有研究认为高浓度Ca2+会抑制真菌生物聚合物的合成［14］。本研究推测Ca2+能够提高胞外虫草素的含量并有利于菌丝体的积累可能是由于提高了虫草素合成过程某些关键酶的活性。

2.2.3不同浓度Mg2+对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量和菌丝体生物量的影响从图5可以看出Mg2+对蛹虫草液体培养过程中胞外虫草素积累影响显著（p＜0.05），当Mg2+为1.0 g/L时，胞外虫草素含量增加最为显著，达到了（182.4±13.31）mg/L；此后，随着Mg2+的增加，胞外虫草素含量虽比1.0 g/L略有下降，但与空白对照相比，仍显著性提高（p＜0.05）。不同浓度Mg2+对其蛹虫草菌丝体生物量的增加不明显，菌丝体干重在（10.5±0.6）～（13.1±0.5）g/L范围内。Mg2+是真菌生长过程中必需的金属离子，可作为许多酶的激活剂，调节和维持细胞渗透压，参与ATP的水解等。本实验中Mg2+提高发酵液中虫草素的含量可能是由于Mg2+显著性的改变了虫草素的代谢流，使其更多的流向虫草素合成代谢。

图5　不同浓度MgSO4对蛹虫草液体培养过程中胞外虫草素含量及菌丝体生物量的影响Fig.5　Effect of different MgSO4concentration on extracellular cordycepin production and DW in submerged cultivation of C.militaris

3　结论

金属离子被认为是与细胞的生长和代谢合成有关的重要物质，本文研究发现对蛹虫草液体培养胞外虫草素产量的影响为：Mn2+的增加效果最为显著，优于Ca2+、Mg2+及I-；而Fe3+、Zn2+对虫草素的产量增加没有显著性的影响；Fe2+、Co2+及Cu2+对虫草素合成具有抑制作用。金属离子的过量或缺失均对细胞的生长和代谢产物的产生会造成一定的影响，因此选择合适的浓度对蛹虫草液体培养产胞外虫草素具有重要的影响。本实验认为适合胞外虫草素积累且不影响菌丝体生物量累积的最佳Mn2+、Ca2+、Mg2+的浓度分别为0.05、0.6、1.0 g/L。

本文仅对影响蛹虫草液体培养产胞外虫草素产量及菌丝体生物量的金属离子的种类及单一添加金属离子时的最适浓度进行了研究。对于两种或多种金属离子复合添加时之间的相互关系（协同、抑制）及最适添加比未涉及，在后续的研究中，将进一步开展。此外，本研究发现金属离子对蛹虫草液体培养过程中虫草素生物代谢合成及菌丝体生物量具有一定的调控作用，因此金属离子如何调控虫草素生物合成代谢途径及机理将是后续研究的重点。

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Effect of metal ions on extracellular cordycepin production in submerged cultivation of Cordyceps militaris

ZHOU Si-jing，LIU Gui-jun*，WANG Ping，SHANG Hong-zhong，GU Hai-ke，YANG Su-ling，MENG You-ting，ZHENG Jie
（Beijing Radiation Center，Beijing 100015，China）

The study was aimed at the effect of different kinds of metal ions on extracellular cordycepin production and biomass by submerged cultivation of Cordyceps militaris.Compounds contained Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，Mn2+，Cu2+，Ca2+，Co2+and I－were added to liquid culture medium respectively to select some kinds of metal ions that could facilitate the extracellular cordycepin production and biomass.And on this basis，the optimum concentration was confirmed.The results suggested that Mn2+，Ca2+and Mg2+significantly improved the production of cordycepin and biomass，and the suitable concentrations were 0.05 g/L Mn2+，0.6 g/L Ca2+and 1.0 g/L Mg2+respectively.

Cordyceps militaris；submerged cultivation；extracellular cordycepin；metal ions；dry cell weight

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0213-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.035

2014-10-13

周思静（1985-），女，硕士研究生，助理研究员，研究方向：微生物辐射育种及食品微生物资源的开发利用，E-mail：zhousijing@hotmail.com。

刘桂君（1980-），女，在职博士，高级工程师，研究方向：微生物辐射育种及食品微生物资源的开发利用，E-mail：Liu_guijun01@163.com。

北京市科学技术研究院“萌芽计划”项目；北京市科学技术研究院“青年骨干计划”项目（201311）。