DNA分析技术在动物纤维鉴别领域的研究进展

董晓东++++杨素英++++丁楠++++俞艳彬

摘要：动物纤维的鉴别属于纺织品检测行业的难题之一，DNA分析技术因其客观准确性而给动物纤维检测客观法带来了曙光。本文主要综述了DNA分析技术鉴别动物纤维的研究现状，介绍了DNA分析技术的原理，并对其应用前景进行了展望。

关键词：DNA技术；动物纤维；PCR扩增；PCR-RFLP技术；real-time PCR技术

1 引言

近几年来，随着人们生活水平的提高，天然动物纤维及皮革制品越来越受到消费者的青睐。目前，动物纤维检测方法主要包括显微镜法 [1]和扫描电镜法[2]，二者均通过纤维鳞片形态特征来对纤维种类进行鉴别。但是，动物纤维的形态特征会因加工条件、气候条件及膳食结构等产生变化[3]，这就给显微镜法的鉴别带来了困难，而且显微镜法对试验人员的经验要求较高，主观干扰大，所以相关行业对客观性高的检测方法的需求越来越大。

近年来，随着DNA分子技术的逐步成熟，研究人员通过鉴别不同动物的DNA序列信息，实现了动物纤维及其混合物的定性定量，并在逐步完善此技术。DNA分子技术由于其检测结果的客观性而广泛应用于司法、医学研究及诊断领域，同以上两种方法相比，DNA法的检测结果更加客观准确。

2 DNA定性定量原理

DNA分子，即脱氧核糖核酸，是由碱基、脱氧核糖和磷酸组成的长链多聚物。不同的生物所具备的DNA分子在长短和结构上有一定的差异，碱基的排列顺序也不尽相同[4]。通过对DNA分子的核苷酸排列顺序进行测定即可实现对动物纤维的定性定量检测。DNA分析检测技术一般包括以下几个步骤：

（1）DNA的提取。动物毛纤维的基因组DNA主要存在于毛囊部分，而纺织类动物纤维一般只取毛干部分，故只能提取毛干线粒体中的DNA。DNA的提取主要包括前处理、分离、纯化和浓缩阶段。此阶段所提取的样品将直接影响到后续的扩增及DNA序列的测定，高质量的DNA是实现DNA检测的第一步，因此，提取的DNA样品应防止其他因素的干扰与污染。

（2）PCR扩增。PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是生物体外特殊的DNA复制反应，能将微量的DNA大幅增加。目标DNA片段经过变性、退火、延伸三个基本反应步骤，在数小时内即可扩增放大数百万倍。

（3）DNA序列的测定。DNA序列测定是检测结果的关键所在。通过不同纤维所具备的特异碱基对排列即可实现对纤维的鉴别。目前，Sanger双脱氧末端终止法在此领域应用较广，通过电泳和放射自显影技术对所提取的DNA片段进行测定，即可对纤维品种进行鉴别。

3 DNA检测技术在动物纤维鉴别中的研究进展

随着DNA分子技术的不断发展，其在动物纤维鉴别领域的研究越来越广。Hamlym P.F.等人在1992年首次制作了绵羊特性DNA探针，实现了对绵羊毛、山羊绒和马海毛的鉴别[5]。由于当时DNA分子技术水平较低，极大地限制了DNA技术在动物纤维鉴别上的应用。

PCR扩增技术成功解决了动物纤维基因组中DNA量少、难以提取的问题。Subramanian等[6]提取纤维毛干中线粒体DNA，通过PCR扩增线粒体DNA细胞色素b基因的保守区域，然后选择合适的酶切位点分析相应保守区的单核苷酸多态性，根据后片段长度的多态性成功鉴别出了山羊绒与绵羊毛。PCR-RFLP技术（限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术）是一种基于PCR扩增的技术，是目前识别山羊绒和绵羊毛的较好方法之一。但是，PCR-PFLP分析较为复杂，一般只能用来做定性分析，不做定量检测。在此基础上，Kirsten等[7]实现了对羊毛、羊绒、骆驼毛、牦牛毛等纤维快速简便的纤维定性分析，并且比较了清洗、漂白和染色等3步处理工序对DNA抽提效果的影响，研究发现每增加一步处理工序都会明显降低DNA的提取率，其中染色工序对DNA分析的破坏最为严重。

金美菊等[8]针对多种产地的羊绒和羊毛试验，利用山羊与绵羊质检特定碱基序列的差别，通过设计不同的引物成功实现对纯羊绒、羊毛以及羊绒羊毛混合纤维定性鉴别。研究发现对于纯羊绒、纯羊毛纤维，采用1组引物（CYTBF/CYTBR）对特定位点特征碱基序列组实现对纤维的鉴别。对于羊绒羊毛混合物，采用羊绒引物（YM1_F/C7YGR1）和羊毛引物（YM1_F/W10YGR1）对混合纤维进行定性鉴别。通过对羊毛、羊绒引物的设计，有效地提高了检测的灵敏度。

相比DNA直接测序法和PCR-RFLP法，Real-time PCR（实时荧光PCR技术）具有简单、准确、快速的特点[9]。Real-time PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计实时监测整个PCR过程，最终通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。费静等[10]设计针对兔和狐线粒体12SrRNA基因的特异性TaqMan探针和引物对，建立了兔毛纤维和狐狸毛纤维的鉴别方法，此方法特异性较好，并且灵敏度达到了1%，并且在验证实例中得到满意的结果。紫山羊绒与牦牛毛在显微镜下外观形态极其相似，非常难以鉴别，Lu等[11]设计针对牦牛毛和紫山羊绒12SrRNA基因的TaqMan探针和引物对，建立了牦牛毛纤维和紫山羊绒纤维的鉴别法，分别对染色和漂白样品分别进行鉴别，鉴别结果也十分满意，灵敏度也达到了1%。陈国培等[12]建立羊毛羊绒荧光PCR检测体系，并对检测方法特异性和检出限进行分析，结果表明此方法特异性好，检出限为10ngDNA，同时对16个样品进行验证检测，结果与传统鉴定方法具有一致性，灵敏度相较于传统方法更优。

Real-time PCR不仅在动物纤维定性上表现优异，而且在定量领域也表现不俗。吉冈阳一郎[13]开发了一套基于Real-time PCR技术而用于动物毛纤维混合比率的鉴定方法，方法结果允差符合标准GB/T 29862规定。国内在此动物纤维定量领域也有一定的研究，Tang等[14]采用Real-time PCR技术，设计了两套针对羊绒和羊毛的探针与引物对，验证了线粒体12sRNA适合羊毛/羊绒混合物的定性试验，同时也对不同比例的样品及经染色整理的样品的定量进行了研究，试验结果与标称值一致性很好。

随着DNA检测技术的不断成熟，将可以对更多的动物纤维进行准确的定性和定量检测分析。

4 难点及展望

DNA检测技术是基于物种DNA序列的特异性，不依赖检测人员主观性，检测结果更加客观。但目前，DNA技术在动物纤维鉴别领域的应用依然存在一系列问题：

（1）高质量DNA的获取。纺织品一般经过较多的前处理及后整理，比如碱处理、染色等，在一定程度上破坏了纤维的DNA结构。

（2）动物纤维自身的色素。天然动物纤维中所含的色素会抑制PCR扩增的进行。

（3）目前DNA定量研究多为二组分混纺产品，正处于起步阶段。多组分混纺产品的DNA定量技术还有待进一步研究[15]。

DNA分析检测技术具有非常广阔的发展前景，目前已在多领域得到广泛引用，我们应加大在这方面的研究和开发力度，以提高我国纺织领域的检验检测水平。

参考文献：

[1]GB/T 16988—2013 特种动物纤维与绵羊毛混合物含量的测定[S].

[2]GB/T 14593—2008 山羊绒、绵羊毛及其混合纤维定量分析方法 扫描电镜法[S].

[3]陈启龙， 唐鑫省.生物芯片技术及其应用前景[J].资源开发与市场，2007，23（8）： 725-727.

[4]陈永青， 谢建平， 谢君，等. DNA科学导论[M]. 北京：科学出版社，2005： 29.

[5]P.F.Hamlyn， G. Nelson，and B.J. McCarthy. Wool-fiber Identification by means of Novel Species-specific DNA probes[J]. J.Text.Inst.，1992，83： 97-103.

[6]Selvis Subramanian，T Karthik，N N Vijayaraaghavan. Single nucleotide polymorphism for animal fiber identification[J]. Journal of biotechnology， 2005， 116（2）： 153-158.

[7]Kirsten Kerkhoff，Gabriel Cescutti，Lothar Kruse，et al..Development of a DNA-analytical method for the identification of animal hair fibers in textiles[J].Textile research journal，2009，79（1）：69-75.

[8]金美菊， 阮勇， 李翔，等. 基于基因技术的羊绒与羊毛纤维定性鉴别方法[J].纺织学报， 2012， 33（8）： 19-23.

[9]贾兴旺，田亚平. 双重实时荧光PCR与DNA测序分析及PCR-RFLP方法检测白细胞介素-6基因启动子区多态性方法的比较研究[J]. 现代检验医学杂志，2008， 23（5）： 6-8.

[10]费静， 董正廉， 周辉，等. 基于荧光定量PCR的兔毛、狐狸毛纤维定性检测方法[J]. 标准与测试， 2012， 40（11）： 56-58.

[11]W.m. Lu， J. Fei，J. Yang，et al. A novel method to identify yak fiber in textile[J].Textile Research Journal，2012，83（8）： 773-779.

[12]陈国培， 赖心田， 唐富润，等. 羊毛及羊绒制品实时荧光PCR鉴定方法研究[J]. 纺织导报， 2013，（2）： 88-91.

[13]吉冈阳一郎.动物毛纤维制品中的动物毛纤维混合比率的鉴定方法[P].中国：03824723.2， 2005，11.

[14]M.F. Tang，W.P. Zhang，and H. Zhou. A real-time PCR method for quantifying mixed cashmere and wool based on hair mitochondrial DNA[J].Textile Research Journal，2014，84（15）：1612-1621.

[15]张小莉， 池海涛， 张经华，等.羊绒和羊毛纤维检测技术研究进展[J].毛纺科技， 2009，37（3）： 56-59.

（作者单位：国家羊绒产品质量监督检验中心，河北省纤维检验局）