A/O生物膜法强化处理石化废水及生物膜种群结构研究

张 楠，初里冰，丁鹏元，王 星，杨 琦，王建龙*（.清华大学核研院环境技术研究室，北京 00084；.中国地质大学（北京）水资源与环境学院，北京 0008；.湖南大学环境科学与工程学院，湖南 长沙 4008）

A/O生物膜法强化处理石化废水及生物膜种群结构研究

张 楠1，2，初里冰1，丁鹏元1，王 星3，杨 琦2，王建龙1*（1.清华大学核研院环境技术研究室，北京 100084；2.中国地质大学（北京）水资源与环境学院，北京 100083；3.湖南大学环境科学与工程学院，湖南 长沙 410082）

采用A/O生物膜反应器处理石化综合废水.反应器在O段添加装有改性聚氨酯泡沫的多孔塑料球载体，强化有机物的降解效率.反应器进水分别为水解酸化池出水（阶段I），石化工业废水与生活污水比例为3:1（阶段II）以及单纯的石化工业废水（阶段III）. 结果表明，尽管进水COD和氨氮波动较大，但出水COD和氨氮的去除率保持稳定，说明生物膜反应器具有较好的抗冲击负荷能力.在HRT为30h， COD和氨氮的去除率为74%～77%和96%～93%，总氮和总磷的去除率为58%和79%.第II阶段进水为工业废水和生活污水混合的处理效果最好，出水COD和氨氮浓度分别为（63±12）mg/L和（0.75±0.28）mg/L.出水总氮主要为硝酸氮，亚硝酸氮的浓度很低（小于0.1mg/L），表明硝化作用进行得较为完全.进水中有机物的分子量主要分布在小于1kDa（70.9%）和大于100kDa（10.4%）.出水中大于10kDa的有机物所占比例减小，分子量主要分布在小于1kDa（56.6%）和1～5kDa（26.2%），表明A/O生物膜反应器对大分子有机物的降解较好.454高通量测序结果表明: 生物膜中变形菌门菌群所占比例最大（60.0%），其次是浮霉菌门（16.9%）和拟杆菌门（9.8%）.在属的水平检测到氨氧化菌（AOB）Nitrosomonas和亚硝酸盐氧化菌（NOB） Nitrospiraceae Nitrospira以及反硝化菌Azospira和Thermomonas.NOB的比例较高，这与反应器较好的硝化作用相一致.

石化废水；A/O生物膜工艺；454高通量测序；污水处理

石化废水是在石油炼化、加工过程中产生的废水，污染物种类多、水质波动大.废水中含有石油类、苯和苯的衍生物等多种难降解有机物，具有较强的生物毒性.单一的处理工艺很难达到处理要求，一般采用几种工艺的组合.常采用物化法预处理，厌氧/好氧生化法二级处理，普遍存在有机物降解不稳定，硝化效果差等问题［1］.

缺氧/好氧（A/O）工艺具有较好的有机物降解能力和脱氮能力，在石化废水处理中常与厌氧水解酸化联用［2］.A/O生物膜复合工艺是在20世纪80年代后期，为了应对污水处理日益严格的排放标准而发展起来的工艺类型.该工艺是在活性污泥工艺的曝气池中直接投加填料，反应池内的生物量由悬浮态污泥和附着态生物膜组成，这样可大幅度提高反应池内的生物量，防止生长缓慢的硝化菌流失.增加系统耐冲击负荷能力，减少污泥产量.尤其适用于现有污水厂的提标改造［3］.

本研究采用A/O生物膜法处理某石化综合污水处理厂废水.通过在好氧段投加载体提高难降解有机物与氮磷的去除效率.研究不同水质条件下反应器对有机污染物的降解效果，并对生物膜的菌群结构进行解析.

1 材料与方法

1.1 实验装置

试验装置如图1所示，反应器由有机玻璃制成，有效容积为43.4L，由一个缺氧A段和2个好氧O段组成，3段的体积比为1:2:2.二沉池有效容积为27.8L，底部回流污泥通过蠕动泵回流至A段，回流比为100%.上清液外排.A段设有搅拌，溶解氧浓度为（0.06±0.03）mg/L，pH 7.74±0.29.O段通过曝气砂棒进行曝气，溶解氧浓度保持在5～7mg/L，pH 7.71～7.89.

在O段投加多孔塑料球载体，球内装有1cm见方的改性聚氨酯泡沫，体积填充率为 40%.通过在发泡配方中加入N-甲基二乙醇胺，同时加入适量的酸性抑制剂，直接发泡制备亲水化阳离子改性的聚氨酯载体，促进微生物在载体表面的吸附作用.改性载体的接触角为66°，总阳离子含量为0.372mmol/g.

图1 A/O生物膜试验装置示意Fig.1 Schematic diagram of the A/O biofilm experimental equipment

1.2 实验用水和运行方案

实验装置建在某化工园区石化综合污水处理厂区内.该污水厂的进水由工业废水和生活污水两部分构成，比例约为3:1.工业废水来源于该公司下属的炼油厂、化肥厂、电石厂、树脂厂等工厂处理后的出水.生活污水主要来自该区域内生活、商业、及学校排水.污水处理采用厌氧水解酸化-A/O工艺.

A/O生物膜反应器接种污泥取自该污水厂的O段曝气池，进水为污水厂水解酸化池的出水.2013年4月下旬开始启动，A段搅拌，O段闷曝，待反应器出水COD去除率达到70%以上时，连续进水.水力停留时间（HRT）为30h，污泥回流率100%，反应器温度通过加热棒控制在23～28℃.启动运行约1个月后，出水水质稳定，载体上可明显观察到生物膜附着，表明反应器启动成功.

反应器处理效果稳定后，运行分3个阶段:第Ⅰ阶段45d，进水为厂区水解酸化池出水；第Ⅱ阶段40d，进水为污水厂进水（即工业废水与生活污水的比例为3:1）；第Ⅲ阶段25d，进水为工业废水.以研究直接采用A/O生物膜工艺处理石化废水的可行性.3个阶段进水的水质列在表1，可以看出，随着工业废水比例的增加，进水COD浓度增大， C/N值增大.进水中总磷的含量较低，pH值稳定在7～8之间，适合微生物生长. BOD5/COD在3个阶段没有显著差别.

定期（每隔2～3d）取样测定反应器进水、出水的COD和氨氮浓度.不定期检测反应器各段COD和氮化合物的浓度分布以及进出水TN和TP浓度.所有的水样均采用0.45μm滤膜过滤后再进行分析.反应器运行90d，取生物膜样品进行微生物种群结构解析；对反应器进、出水进行分子量分级测试以及溶解性微生物产物（SMP）、蛋白质、多糖和腐植酸含量检测，分析其水质特性的变化规律.

表1 实验用水主要水质指标Table 1 Characteristics of the influent

1.3 分析方法

COD、氨氮、硝酸氮和亚硝酸氮的测定均采用标准方法［4］.TOC和TN采用总有机碳分析仪（TOC-VCPH/CPN，岛津）测定.蛋白质采用考马斯亮蓝法测定，多糖采用苯酚硫酸法测定［5］，腐植酸采用比色法测定；溶解氧和温度采用便携式溶氧仪测定（YSI 550A）.

采用超滤法对进出水进行分子量分布测定.超滤操作采用逐级过滤方式进行［6］，所用仪器为Millipore公司的Models 8400超滤杯以及截留分子量分别为100，30，10，5，3，1kDa的新型再生纤维素膜，超滤杯的有效容积为400mL，过滤面积为4.18×10-3m2，内置磁力搅拌器，加压气体为0.1MPa的高纯氮气.

采用454高通量测序的方法解析微生物种群结构［7］.生物膜样品经DNA提取和纯化，在指定测序区域，连接带有5’454A、B接头-特异引物3’的融合物，PCR扩增样品中的相应基因，反应产物用2%琼脂糖电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收.参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量，取合适的浓度进行EmPCR（平行扩增）.用Roche Genome Sequencer FLX系统测序（上海美吉生物医药科技有限公司）.所得结果进行过滤处理，得到优化序列.对优化序列在97%相似度水平进行OTU聚类分析和物种分类学分析，分析样品的多样性以及群落结构.

2 结果与讨论

2.1 有机物和氮磷的去除

运行初期，装有改性聚氨酯泡沫的塑料球载体漂浮在水面上；随着生物膜在载体表面和内部的附着和生长，载体浸没在水中，在水流和气体的作用下，在反应器内上下翻滚.反应器的污泥浓度保持在5500～6900mg TSS/L，VSS与TSS的比值在70%～72%，污泥活性较高.如图2所示，尽管进水COD波动较大，但反应器对COD的去除效率保持稳定，说明生物膜反应器具有较好的抗冲击负荷能力.第Ⅰ和第II阶段，出水COD差别不大，分别为（67±6）mg/L和（63±12）mg/L.到第III阶段，进水全部为工业废水，进水COD较高，出水COD增加到（107±18）mg/L，但COD的去除率保持不变.3个阶段COD的平均去除率为74%、78%和77%.第II阶段进水为工业废水和生活污水混合的效果最好.稳定状态下，3个阶段出水的pH值分别为8.15±0.14、7.90±0.14和7.32±0.18.出水BOD5非常低（小于4.5mg/L），BOD5/COD均小于0.04，SS均小于10mg/L.

由于回流消化液的稀释A段COD约为进水的一半.COD的降解主要在好氧O段，有机物在O段基本完成降解.二沉池污泥絮凝沉降过程中，也会吸附一部分有机物，使COD进一步降低.

稳定状态下，反应器进出水氨氮浓度和氨氮去除率的变化如图3所示.反应器对氨氮的去除效率较高，3个阶段出水的氨氮浓度分别为（0.79±0.19），（0.75±0.28）和（1.30±1.28）mg/L，平均去除率为96.2%、95.4%和92.6%，远高于COD的去除效率.单纯的工业废水成分复杂，对硝化细菌的活性有一定抑制作用，使出水的氨氮浓度较前两个阶段有较大升高.与COD降解趋势相似，氨氮降解主要发生在好氧O段. 氨氮发生硝化作用转化为硝酸氮.

图2 反应器进出水COD和去除率随运行时间的变化Fig.2 Time course of COD concentration in the influent and effluent and COD removal efficiency

图3 反应器进出水氨氮浓度和去除率随运行时间变化Fig.3 Variation of ammonium concentration in the influent and effluent and ammonium removal efficiency with operation time

A/O生物膜反应器出水总氮主要以硝酸氮的形式存在，亚硝酸氮的浓度很低，均小于0.1mg/L，表明硝化作用进行得较为完全.出水硝酸氮的增加主要来自于氨氮和有机氮的转化，3个阶段出水硝酸氮浓度分别为（9.7±2.5），（6.0± 2.40和（10.1±5.2）mg/L.3个阶段反应器TN的去除率分别为56.3%、58.2%和48.0%.第Ⅱ阶段硝化和反硝化速率均较高.单纯的工业废水尽管有机物含量高，但生物降解性差，难以被反硝化菌所利用. A/O反应器对于总磷的去除过程符合厌氧释磷、好氧吸磷的规律，TP的去除率在79%以上，出水中总磷浓度低于1.0mg/L，达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》［8］一级标准.

2.2 进出水性质分析

SMP是细菌在降解底物、合成细胞过程中形成的溶解性有机物，对于生化处理污水的出水水质和处理效率有重要的影响，其主要成分为腐植酸、多糖和蛋白类［9］.如图4所示，出水中SMP的主要成分是腐植酸.3个阶段下，SMP占出水COD的百分比分别为46.5%，50.5%和36.1%，在第II阶段所占比例最高，是出水中需要进一步去除的主要物质.由此可见，进水中有一定的生活污水时，水中容易降解的有机物很快被降解完成，更多的微生物进入内源呼吸阶段，产生较多的SMP.在第III阶段，由于工业废水中有害物质较多且难于降解，进入内源呼吸阶段的微生物相对较少，产生的SMP比例降低，出水中物质种类也更为复杂.

图4 进出水SMP各组分的变化Fig.4 Changes in SMP composition in the influent and effluent

生物降解对废水中有机物的相对分子质量的变化有显著影响.由图5可以看出，原水中的有机物分布广泛，主要集中在小于1kDa（70.9%）和大于100kDa（10.4%），在3～10kDa间也有较大比例（12.4%）.出水大于100kDa的分子量所占比例降为2.7%，小于1kDa的分子量所占比例降为56.6%，有机物分子量主要分布在小于1kDa（56.6%），1～5kDa（26.2%）.杨赛等［10］利用改良的SBR处理市政污水，出水中大于100kDa的分子量所占比例反而上升.分析原因，市政污水较石化废水易降解，微生物利用小分子量物质进行新陈代谢，产生胞外聚合物和SMP等大分子物质，而本研究石化废水中含有大分子难降解有机物，可以通过A/O生物膜强化工艺降解为小分子溶解性有机物.这与UV254的测定结果一致，反应器出水的UV254显著降低，3个阶段平均值分别为0.5、0.6和0.9，去除率大于60%，表明反应器对大分子芳香性难降解有机化合物的去除效果较好［11］.

图5 进出水中有机物相对分子质量分布Fig.5 Molecular weight distribution of the influent and effluent

2.3 生物膜种群结构解析

载体生物膜454测序收获23908个有效序列，优化后得到17046个序列.将这些序列进行归类操作，得到OTU数为2240.在97%相似度水平，对所有序列进行OTU划分，然后进行多样性指数分析和群落结构的分类学分析.chao1和ace指数在生态学中常用来估计物种总数，可以表征菌群丰度；shannon指数常用来定量描述一个区域的生物多样性，其值越大，说明群落多样性越高.载体生物膜的chao1、ace和shannon指数较高，分别为3954，4852和5.96，表明其具有较高的菌群丰度和多样性.

在门的水平，生物膜的细菌种群分布如图6所示.可以看出主要菌群为变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门 （Planctomycetes）、拟杆菌门 （Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门 （Acidobacteria）、绿菌门（Chlorobi）、放线菌门（Actinobacterium）、蓝藻门（Cyanobacteria）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）.其中变形菌门菌群所占比重最大（60.0%），其次是浮霉菌门（16.9%）和拟杆菌门（9.8%）.

图6 在门的水平上载体生物膜菌群的相对丰度Fig.6 Relative abundance of bacterial community of biofilm at phylum levels

生物膜中的优势菌群变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多可以进行固氮的细菌，包含多种代谢种类，在常规活性污泥系统、脱氮系统、除磷系统中分别占81%、80%和58%［12-15］，在降解有机物的同时完成整个系统的脱氮除磷功能［16-17］.浮霉菌门是一小门水生细菌，其中一类和浮霉菌属等关系较远的细菌Planctomycetes sp.，能在缺氧的环境下利用亚硝酸盐氧化铵离子生成氮气来获得能量，被称作厌氧氨氧化菌，对系统脱氮起重要作用［16］.本系统中检测少量Planctomycetes属细菌，所占比例为0.9%.在种（species）的水平，检测到Planctomycetes sp.所占比例为0.03%.拟杆菌门菌群常在除磷系统中被报道，可降解蛋白质、糖类等物质［18］.绿弯菌门细菌是兼性厌氧微生物，在光合作用中不产生氧气，不能固氮，主要用来分解糖类物质［19］，降低出水中糖类物质所占比重.一般处理工业废水的活性污泥中放线菌比例较高，能好氧吸磷，厌氧利用氨基酸为有机碳源，随原水中碳源种类的增多而增加［20］.硝化螺旋菌是一类革兰氏阴性细菌，为重要的亚硝酸盐氧化菌［21-22］.

表2 在属的水平鉴定出的优势菌以及AOB、NOB和反硝化菌及其丰度Table 2 Relative abundance of the dominant bacteria and AOB， NOB and denitrifies at genus levels

表2列出了在属（genus）的水平，鉴定出的优势菌以及氨氧化菌（AOB），亚硝酸氧化菌（NOB）和反硝化菌及其丰度. Flexibacter属于拟杆菌门，Gemmata属于浮霉菌门， Defluviicoccus，Comamonas， Legionella， Azospira和Thermomonas都属于变形菌门.检测到AOB Nitrosomonas和NOB Nitrospiraceae Nitrospira. NOB的比例较高，这与反应器较好的硝化作用相一致，亚硝酸氮基本上可以完全氧化为硝酸氮. Azospira和Thermomonas具有反硝化功能［23］.实验结果表明，反应器O段总氮的去除效率为（21±10）%，这与在O段检测出的反硝化菌相对应.说明在聚氨酯载体内部存在厌氧微环境，可以同时进行硝化与反硝化反应，且对系统脱氮有一定的贡献.

3 结论

3.1 尽管进水COD波动较大，但出水COD和氨氮的去除效率保持稳定.在HRT为30h， COD和氨氮的去除效率为74%～77%和96%～93%.说明生物膜反应器具有较好的抗冲击负荷能力.COD和氨氮的降解主要发生在O段.

3.2 出水总氮主要为硝酸氮，亚硝酸氮的浓度很低，均小于0.1mg/L，表明硝化作用进行得较为完全.

3.3 出水中SMP的主要成分是腐植酸.3个阶段下SMP占出水COD的比例分别为46.5%，50.5%和36.1%.在第II阶段所占比例最高，是需要进一步去除的主要物质.

3.4 原水中有机物的分子量主要分布在小于1kDa（70.9%）和大于100kDa（10.4%）.出水中大于10kDa的有机物所占比例减小，分子量主要分布在小于1kDa（56.6%）和1～5kDa（26.2%）.这与UV254的测定结果一致，反应器出水的UV254显著降低，去除率大于60%，表明反应器对大分子芳香性难降解有机化合物的去除效果较好.

3.5 载体生物膜样品的454高通量测序结果表明:变形菌门菌群所占比重最大（60.0%），其次是浮霉菌门（16.9%）和拟杆菌门（9.8%），其它优势菌群有绿弯菌门、酸杆菌门、绿菌门、放线菌门、蓝藻门和硝化螺旋菌门.在属的水平检测到AOB Nitrosomonas和NOB Nitrospiraceae Nitrospira以及反硝化菌Azospira和Thermomonas.NOB的比例较高，这与反应器较好的硝化作用相一致.

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Enhanced treatment of petrochemical wastewater by using A/O biofilm reactor and analysis of biofilm community.

ZHANG Nan1，2， CHU Li-bing1， DING Peng-yuan1， WANG Xing3， YANG Qi2， WANG Jian-long1*（1.Laboratory of Environmental Technology， Institute of Nuclear and New Energy Technology， Tsinghua University， Beijing 100084，China；2.School of Water Resources and Environment， China University of Geosciences， Beijing 100083， China；3.College of Environmental Science and Engineering， Hunan University， Changsha 410082， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：80～86

An A/O biofilm reactor was developed for the treatment of petrochemical wastewater. Porous plastic spherical carriers filled with modified polyurethane foams were added in the aerobic parts to improve the degradation of organic pollutants. The A/O biofilm reactor was fed with effluent from the hydrolysis acidification tank （phase I）， a mixed petrochemical and domestic wastewater with a ratio 3:1 （phase II） and petrochemical wastewater （phase III）， respectively. Results showed that the removal efficiency of COD and ammonium maintained stable despite their great fluctuation in influent， indicating that the A/O biofilm reactor had a good capacity to resist the loading shock. At a hydraulic retention time of 30h， COD and ammonium removal reached 74%～77% and 96%～93%， respectively. Total nitrogen and total phosphorus removal were 58% and 79%， respectively. The performance of reactor at phase II was the best. The effluent COD and ammonium concentrations kept at （63±12）mg/L and （0.75±0.28）mg/L， respectively. Total nitrogen in the effluent existed mainly in the form of nitrate and nitrite maintained at low levels （less than 0.1mg/L）， which indicated that nitrification proceeded almost completely. The molecular weight （MW） of organic matters in the influent ranged mainly in less than 1kDa （70.9%） and more than 100kDa （10.4%）. In the effluent， MW of organic matters was mainly in less than 1kDa （56.6%） and 1～5kDa （26.2%）. The distribution ratio of organics with a MW of higher than 10kDa decreased，indicating that A/O biofilm reactor was good at degradation of the macromolecular organics. Analysis of454pyrosequencing showed that Proteobacteria accounted for most of sequence （60.0%）， followed by Planctomycetes（16.9%） and Bacteroidetes （9.8%） at the phylum levels. At the genus levels， ammonia oxidizing bacteria （AOB）Nitrosomonas and nitrite oxidizing bacteria （NOB） Nitrospiraceae Nitrospira and denitrifier Azospira and Thermomonas were identified. NOB were highly enriched which was consistent with the good nitrification.

petrochemical wastewater；A/O biofilm process； 454 high-throughput pyrosequencing；wastewater treatment

X703

A

1000-6923（2015）01-0080-07

张 楠（1989-），女，山东德州人，中国地质大学硕士研究生，研究方向为水污染控制.

2014-05-06

国家水体污染控制与治理重大专项 （2012ZX07201-005-06-01）； 重点防控重金属汞、铬、铅、镉、砷便携/车载/在线监测仪器开发与应用（2012YQ060115）

* 责任作者， 教授， wangjl@tsinghua.edu.cn