常温厌氧MBR中微生物群落结构与膜污染研究

隋力新，胡 奇，高大文（哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150090）

常温厌氧MBR中微生物群落结构与膜污染研究

隋力新，胡 奇，高大文*（哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150090）

为考察微生物群落结构与膜污染的关系，在常温下运行厌氧膜生物反应器，并应用末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）技术，对膜丝表面微生物群落结构变化进行了研究，同时考察了微生物群落结构变化与反应器中溶解性微生物产物（SMP）、胞外聚合物（EPS）的关系.结果表明:在常温状态下膜污染周期约为18d，CODCr的去除率约为93%，运行效果稳定；微生物代谢产物的浓度随着微生物种群的演替呈逐渐升高的趋势，加速了膜污染进程；膜压（pTM）处于缓慢上升期时，膜丝表面微生物优势菌群为Raoultella、Owenweeksia hongkongensis，膜压（pTM）处于稳定上升期时，膜丝表面的优势菌群演替为 Delftia acidovorans、Halothiobacillus neapolitanus，最后当膜压（pTM）处于快速上升期时，bp78的微生物成为了膜丝表面的顶级群落.膜压（pTM）处于缓慢上升期和稳定上升期时，膜压（pTM）与微生物群落结构的多样性呈显著正相关；膜污染进入快速上升期时，膜丝表面出现了顶级群落，此时微生物群落多样性明显降低且与膜压升高呈弱相关；膜丝表面微生物群落均匀度随着膜压（pTM）的升高呈现出先增高后降低的趋势，膜丝表面微生物群落经历了不断附着，相互竞争至顶级群落出现的演替过程.

厌氧膜生物反应器；膜污染；末端限制性片段长度多态性；微生物群落结构；生物多样性

近年来，厌氧工艺越来越多的被应用到生活污水的处理研究当中［1］.然而，受温度的限制，厌氧生活污水处理工程多见于热带地区［2］.如何将厌氧技术应用到常温甚至低温地区成为研究热点.膜技术的出现，使得传统的好氧工艺与膜过滤技术同时应用到了生活污水处理中，从而进一步提高了好氧工艺出水质量［3］.然而，膜污染问题却始终制约着膜技术的推广.目前，好氧膜生物反应器中影响膜污染的因素已经得到了广泛的研究［4］，其中，污泥浓度、SMP/EPS、膜组件等因素都会影响膜污染速率.近几年，厌氧与膜技术的结合成为了新的研究热点，然而厌氧处理过程中更高的污泥浓度与更长的污泥停留时间使得膜污染问题更为严重［5］，影响膜污染的各种因素已经受到了广泛的关注［6-7］，但其中微生物群落结构与代谢产物关系、膜丝表面微生物群落结构变化与膜污染关系的研究较少.

本研究通过在常温状态下稳定运行厌氧膜生物反应器，考察了膜污染过程中微生物群落结构的变化以及膜丝表面微生物群落结构变化与代谢产物之间的关系，用以探讨常温厌氧条件下膜污染的机理，从而为延长膜污染周期提供参考.

1 材料与方法

1.1 污水与污泥

反应器进水为人工模拟污水，其中进水CODCr平均380.5mg/L，pH 7.13～7.62，平均7.32.试验接种污泥为某污水处理厂二沉池污泥，污泥浓度约为20g MLSS/L.污泥经过一定时间的驯化，达到了稳定运行的状态，本研究过程中未排泥.

1.2 反应器装置与运行条件

反应装置为一体式厌氧膜生物反应器［8］，总体积为7.6L，有效体积5.8L，由外筒、中筒、内筒、三相分离器、膜组件5个主要部分构成.进水经由外筒（反应区）底部升流进入，经过三相分离器溢流进入中筒，最后经过内筒的中空纤维膜出水.一个膜污染周期结束后，对膜组件进行更换，采用的两套膜组件为日本三菱公司生产的PE中空纤维膜，膜丝孔径0.4µm，最大理论通量0.27m3/ （m2·d）.

温度控制（25±0.3）℃，采用连续进出水的运行方式.水力停留时间8h，膜组件通量0.107m3/（m2·d）.

1.3 检测方法

1.3.1 常规检测方法 每天检测进出水CODCr、挥发酸［9］，以及反应器中溶解性微生物产物（SMP）和胞外聚合物（EPS），多糖和蛋白是SMP及EPS的主要组成成分，取其和为实际值.多糖采用苯酚浓硫酸法测定，蛋白采用改良型BCA蛋白试剂盒（上海生工）进行测定.反应器中DO和pH使用WTW（pH/Oxi34Oi）手提式多参数测试仪测定.膜压变化由压力传感器在线记录.

1.3.2 微生物种群检测 应用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术［10-11］，分析不同膜压下微生物种群，操作过程详见文献［12-13］.实验应用的细菌16SrDNA扩增引物为带有FAM荧光标记的8F与1492R.限制性内切酶HAEIII［14］酶切扩增片段，得到的T-RF片段通过与自建文库比较来确定微生物种属.

2 结果与讨论

2.1 反应器运行效能

2.1.1 运行效果 反应器在25℃下连续运行52d，图1为3个膜污染周期下CODCr的去除效果.第1个膜污染周期（0 ～15d）出水CODCr略有波动，为20～50mg/L，去除率为82%～90%；第2、3个周期（16～52d）出水CODCr稳定在30mg/L左右，去除率为93%左右，维持了稳定的去除效果.

图1 不同膜污染周期下COD的去除效果Fig.1 The efficiency of COD removal rate in different periods

图2中，第1个膜污染周期中出水挥发酸累计浓度较高约为18mg/L，随后的2个周期内挥发酸累计浓度在10mg/L左右波动，均未出现积累现象.从CODCr和挥发酸的去除情况来看，反应器在常温条件下对CODCr有较高的去除率，并未出现挥发酸积累影响反应器运行的情况.

图2 膜污染周期中VFAs平均值Fig.2 The average concentrations of VFAs in membrane fouling periods

图3 膜污染周期下pTM变化情况Fig.3 The changes of pTMin different periods

2.1.2 膜污染 由图3可见，第1个膜污染周期持续时间较短（0～15d），膜污染发生速度较快，整个周期中膜压力持续上升，上升速率为3.07kPa/d.第15～ 32d为第2个膜污染周期，反应器内微生物群落结构趋于稳定，膜压变化呈现出3个阶段的变化特征:第1阶段（15～22d）膜压缓慢上升，速率为2.73kPa/d，此时反应器中一些比较大的颗粒在膜丝表面富集，但未对出水造成明显阻碍作用；第2阶段（23～28d），膜压上升速率为0.372kPa/d，膜丝表面的浓差极化现象达到平衡，膜压稳定在25kPa左右，膜丝表面的微生物开始增多，微生物之间激烈地竞争导致了不同代谢产物的分泌，从而进一步加重了膜污染；第3阶段（29～32d）膜压迅速上升，速率为3.75kPa/d，由于污染物质的积累以及微生物生长的作用，膜丝表面开始形成了致密的泥饼层，导致了膜压的迅速上升，膜组件出水困难.第33～52d为第3个膜污染周期，膜压变化与第2个周期趋势相似，第33～44d为缓慢上升期，速率为2.27kPa/d，第45～48d膜压变化很小，速率为0.235kPa/d，第49～52d膜压又迅速上升，速率为3.50kPa/d.

2.2 微生物群落结构分析

针对一个稳定的膜污染周期（第3周期），在不同膜压情况下对反应器内微生物及膜丝表面的微生物取样，测得的微生物群落结构见图4.

图4 不同膜污染程度下微生物群落结构图谱Fig.4 The pattern of microbial community structure in different membrane fouling periods

从图4可知，当膜污染处在缓慢上升阶段（膜压为20kPa）时，厌氧反应器中肠杆菌属Raoultella terrigena 为优势种群，其次为bp68 （T-RFLP得到的酶切片段）的微生物.此时，膜丝表面微生物呈现出相同的分布现象，优势种群主要为肠杆菌属Raoultella terrigena与bp68微生物.通过与伯杰细菌手册对比发现肠杆菌属Raoultella terrigena发酵葡萄糖产酸产气.此阶段随着膜压的缓慢上升，反应器中还出现了部分兼性厌氧细菌Owenweeksia hongkongensis（黄杆菌属的一种），同时膜丝表面亦包含部分Delftia acidovorans（丛毛单胞菌属的一种）.反应器结构使得外筒中的优势微生物有更多的机会流入内筒与膜组件接触［8］，所以在反应器中与膜丝表面，肠杆菌属Raoultella terrigena与bp68菌属为优势菌属.

膜压继续上升达到稳定期（膜压为25kPa）时，反应器中Owenweeksia hongkongensis，bp78 的微生物及Delftia acidovorans占主要比例.膜丝表面出现的bp78微生物与代尔夫特菌Delftia acidovorans代替了肠杆菌属Raoultella terrigena与bp68微生物，成为了优势菌群.这种现象是随着膜压逐渐升高，膜丝表面聚集的微生物在不断增加，微生物之间竞争导致的群落演替的结果.

当膜压继续升高（达到约40kPa）时，反应器中的生物种群无明显变化，而膜丝表面附着微生物的种类则逐渐增多，其中bp78长度的微生物成为了膜丝表面的优势种群.从膜丝表面微生物变化来看，膜污染过程是附着在膜丝表面的微生物种群之间，不断竞争最后达到优势种群的过程.具体来看，快速上升期膜丝表面的微生物已出现了优势菌群，且达到了稳定的状态，而缓慢上升期及稳定期的膜丝表面微生物种群仍然处在相互竞争之中.因此，可以通过控制反应器的运行条件来延长缓慢上升期和稳定期膜丝表面微生物的演替过程，即通过控制或延长膜丝表面优势菌群的形成过程，便可以延长膜污染周期.

2.3 微生物代谢产物分析

2.3.1 反应器中EPS的变化 高EPS浓度往往导致膜污染的发生［15］，本研究取一个稳定的膜污染周期，测得EPS在膜污染周期内的变化情况（图5），其浓度呈现出缓慢上升的趋势.

膜污染前期EPS浓度维持在35～40mg/g，随着膜污染的加剧，EPS浓度不断增加至最高约54mg/g.EPS浓度的变化与反应器内优势菌群有关，在pTM为20kPa时，肠杆菌属Raoultella terrigena等为革兰氏阳性细菌且能够分泌粘液层，其在反应器中占有着主要的地位，是EPS的主要贡献者.这种高浓度EPS加速膜污染的现象与Aquino等［16］的研究结果相似.

图5 膜污染周期中EPS的变化Fig.5 The concentration of EPS in a membrane fouling period

图6 膜污染周期中SMP的变化情况Fig.6 The concentration of SMP in a membrane fouling period

2.3.2 反应器中SMP变化 很多研究阐述了SMP的浓度以及SMP组成成分对膜污染的影响［17-19］，本文研究了一个膜污染周期中反应器内SMP的变化情况（图6）.当膜压低于20kPa时，反应器中SMP浓度15～25mg/L，缓慢上升；当膜压稳定在25kPa左右时，反应器中SMP浓度维持在28mg/L左右，趋于稳定状态；当膜压处于快速上升时期时，反应器中的SMP浓度快速增加，最后达到约40mg/L.反应器中SMP整体的变化趋势与膜压变化趋势相似，其主要原因在于膜组件对SMP的截留作用:膜污染前期膜组件对SMP的截留作用很小，部分SMP被排出反应器；随着膜污染的加重，膜丝表面形成的泥饼层对反应器中的污染物质起到了截留作用，导致SMP浓度随着膜污染的加剧而不断升高.

伴随着膜污染的不同阶段，反应器内的微生物也在发生着演替，各阶段优势种群的不同导致了代谢产物的差异.反应器的运行条件决定了微生物的演替过程，也影响了微生物代谢产物SMP及EPS的浓度.因此，反应器运行参数（如温度、pH值、HRT等）的控制会影响到微生物代谢产物的形成，从而影响膜污染.

2.4 微生物群落与膜污染关系分析

2.4.1 微生物群落多样性与膜污染关系 为了表征不同膜污染时期微生物群落的多样性，本研究引入了Shannon指数H.同时需要描述微生物群落结构与膜污染之间的关系，引入滤阻R来表征膜压与膜污染的关系.通过R与透水率K-1［kPa/L（m2·h）］成正比的关系，得到pTM与K-1成正比［20］.

表1 Shannon指数H与透水率K-1关系Table 1 The relationship between the index of H and permeability K-1

Pearson系数（rp，无量纲）可以用于2组数据之间相关性的分析，取值范围在-1.0～1.0之间，其绝对值越大两个数据集合的相关性越高.

应用SPSS软件对表1中微生物群落结构Shannon 指数H 与K-1相关性分析可知:在膜污染进入快速上升期之前（pTM在25kPa以下时），以透水率K-1为横坐标，以Shannon指数H为纵坐标得出了拟合公式y = 0.2399x + 0.9365（rp= 0.999P = 0.022），Pearson系数在置信度为0.05的水平上，透水率K-1与微生物Shannon指数表现出显著相关（rp= 0.999，P = 0.022，置信度为95%）；但当膜污染进入快速上升期（pTM大于25kPa以后），膜丝表面微生物之间的竞争导致顶级菌群出现，同时Shannon指数值H迅速降低，此时H 值与K-1相关性表现出微弱相关.以上生物统计学分析表明:当膜丝表面污染程度处在较低水平时，膜污染的原因是不同微生物在膜丝表面持续积累、微生物群落多样性不断增大导致的膜压升高，但是微生物群落多样性的增高并没有造成严重的膜污染；当膜污染进入后期，微生物之间的竞争关系不断加剧，顶级菌群的产生与微生物代谢产物浓度的不断增高，成为了膜污染的主要原因.

2.4.2 微生物群落均匀度与膜污染关系 为了描述微生物群落均匀度与膜压之间的关系，本研究引入了PL均匀度曲线，45°直线为完美曲线，表示微生物群落均匀度最高，偏离完美曲线越远说明优势菌群的地位越突出.

图7 微生物群落均匀度与膜压（pTM）的关系Fig.7 The relationship between microbial evenness and membrane pressure

图7中，当膜压（pTM）为5kPa时，微生物群落均匀度曲线远离完美曲线，优势种群明显，这是由于膜污染初期易附着微生物在膜丝表面聚集成为了优势菌群；膜压（pTM）逐渐上升至25kPa的过程中，均匀度曲线逐渐靠近完美曲线，膜丝表面的微生物群落均匀度升高，究其原因是膜丝表面微生物种类与含量不断升高，微生物种群之间对生态位的竞争不断加剧，使得膜污染初期的优势菌群不断退化，微生物群落的均匀度升高，这也是膜压（pTM）进入快速上升期之前膜污染的一个主要原因，微生物种群之间的竞争必然会导致顶级群落的出现，与此同时膜压（pTM）进入快速上升时期；当膜压（pTM）为40kPa时，顶级群落又使得均匀度曲线远离完美曲线，这与Gao等［21］研究结果相近.整个膜污染过程中膜丝表面微生物群落的均匀度随着膜污染的加重呈现出先增加后降低的变化趋势，这也与微生物多样性与膜污染相关系分析得到的结果相吻合.

3 结论

3.1 常温下厌氧膜生物反应器对模拟生活污水中CODCr有很好的去除效果，去除率可达到93%.

3.2 厌氧膜生物反应器中膜污染的变化呈现出3阶段，3阶段中膜丝表面优势菌群不同.前后经历了膜污染初期的肠杆菌属Raoultella terrigena， bp68微生物，中期的香港海鸥根Owenweeksia hongkongensis，代尔夫特菌属Delftia acidovorans，后期的bp78长度微生物占据优势地位的演替过程.

3.3 在整个膜污染过程中，群落结构的变化导致反应器中SMP及EPS浓度的不断增加，高浓度的EPS及SMP成为了膜污染的主要原因.

3.4 通过对膜丝表面微生物群落多样性与膜压变化的相关性分析得知，膜污染初期微生物的群落分布越均匀，膜污染越严重；当膜污染进入快速上升期后，膜丝表面出现了顶级群落，这时微生物群落的多样性与膜压变化呈现出微弱相关.

［1］Seghezzo L， Zeeman G， Van Lier J B， et al. A review: the anaerobic treatment of sewage in UASB and EGSB reactors ［J］. Bioresource Technology， 1998，65（3）:175-190.

［2］Aiyuk S， Forrez I， Lieven D K， et al. Anaerobic and complementary treatment of domestic sewage in regions with hot climates—A review［J］. Bioresource Technology， 2006，97（17）:2225-2241.

［3］高大文，李听芯，安 瑞，等.不同DO下MBR内微生物群落结构与运行效果关系 ［J］. 中国环境科学， 2010，30（2）:209-215.

［4］赵建伟，丁蕴铮，苏丽敏，等.膜生物反应器及膜污染的研究进展［J］. 中国给水排水， 2003，19（5）:31-34.

［5］Gao D W， Zhang T， Tang C Y Y， et al. Membrane fouling in an anaerobic membrane bioreactor: Differences in relative abundance of bacterial species in the membrane foulant layer and in suspension［J］. Journal of Membrane Science， 2010，364（1）:331-338.

［6］Akram A， Stuckey D C. Flux and performance improvement in a submerged anaerobic membrane bioreactor （SAMBR） using powdered activated carbon （PAC） ［J］. Process Biochemistry， 2008，43（1）:93-102.

［7］徐 毅，王占生，杜晓文，等. HRT对一体式PTFE膜生物反应器运行效果的影响 ［J］. 中国环境科学， 2012，32（12）:2192-2198.

［8］Gao D W， Hu Q， Yao C， et al. Integrated anaerobic fluidized-bed membrane bioreactor for domestic wastewater treatment ［J］. Chemical Engineering Journal， 2014，240:362-368.

［9］魏复盛，国家环境保护总局，水和废水监测分析方法编委会.水和废水监测分析方法 ［M］. 北京:中国环境科学出版社， 2002.

［10］张 斌，孙宝盛，季 民，等.MBR中微生物群落结构的演变与分析 ［J］. 环境科学学报， 2008，28（11）:2192-2199.

［11］Osborne C A， Rees G N， Bernstein Y， et al. New threshold and confidence estimates for terminal restriction fragment length polymorphism analysis of complex bacterial communities ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2006，72（2）:1270-1278.

［12］Schütte U M E， Abdo Z， Bent S J， et al. Advances in the use of terminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP） analysis of 16S rRNA genes to characterize microbial communities ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2008， 80（3）:365-380.

［13］Padmasiri S I， Zhang J， Fitch M， et al. Methanogenic population dynamics and performance of an anaerobic membrane bioreactor（AnMBR） treating swine manure under high shear conditions ［J］. Water Research， 2007，41（1）:134-144.

［14］Ziganshin A M， Schmidt T， Scholwin F， et al. Bacteria and archaea involved in anaerobic digestion of distillers grains with solubles ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2011，89（6）:2039-2052.

［15］Chu L B， Yang F L， Zhang X W. Anaerobic treatment of domestic wastewater in a membrane-coupled expended granular sludge bed （EGSB） reactor under moderate to low temperature ［J］. Process Biochemistry， 2005，40（3）:1063-1070.

［16］Aquino S F， Hu A Y， Akram A， et al. Characterization of dissolved compounds in submerged anaerobic membrane bioreactors（SAMBRs） ［J］. Journal of Chemical Technology and Biotechnology， 2006，81（12）:1894-1904.

［17］刘 锐，黄 霞.膜生物反应器中溶解性微生物产物的研究进展［J］. 环境污染治理技术与设备， 2002，3（1）:1-7.

［18］Aquino S F， Hu A Y， Akram A， et al. Characterization of dissolved compounds in submerged anaerobic membrane bioreactors（SAMBRs） ［J］. Journal of Chemical Technology and Biotechnology， 2006，81（12）:1894-1904.

［19］Zhang L， Li W G， Zhang D Y， et al. The characteristic of the soluble microbial products from an anaerobic reactor at low temperature ［J］. Advanced Materials Research， 2012，518:1808-1812.

［20］高大文，辛晓东.MBR膜污染过程中微生物群落结构与代谢产物分析 ［J］. 哈尔滨工业大学学报， 2014，（46）2:26-32.

［21］Gao D W， Wen Z D， Li B， et al. Microbial community structure characteristics associated membrane fouling in A/O-MBR system［J］. Bioresource Technology， 2014，154:87-93.

The relationship between microbial community structure and anaerobic MBR membrane fouling at a room temperature.

SUI Li-xin， HU Qi， GAO Da-wen*（State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment，Harbin Institute of Technology， Harbin 150090， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：110～115

An anaerobic membrane bioreactor was run at a room temperature to investigate the relationship between microbial community structure and membrane fouling. Changes in the microbial community structure of membrane surfaces were studied by terminal restriction fragment length polymorphism analysis （T-RFLP） technology. The relationship between the microbial community structure and soluble microbial products （SMP）， extracellular polymeric substances （EPS） were also investigated. Membrane fouling period was 18d at a room temperature， and the removal rate of CODCrwas approximately 93%. The succession of microbial populations made the concentration of microbial metabolites gradually increased and accelerated the process of membrane fouling. The dominant microbial species of membrane surface were Raoultella， Owenweeksia hongkongensis when film pressure was slowly rising. When the pressure rose steadily， the dominant bacteria changed into Delftia acidovorans， Halothiobacillus neapolitanus. At last， the microbe of bp78 become the climax community. When the membrane fouling is through the slow rising period and steady rising period， the pressure （pTM） and the diversity of microbial community structure showed a significant positive correlation. When membrane fouling was in the rapid rising stage， top community appeared on the surface of the membrane silk， and microbial community diversity decreased significantly. At this point， the diversity of microbial community structure showed weakly related with the membrane pressure. The evenness of microbial community on membrane surface increased firstly and then decreased as membrane pressure rose， and the microbe continued to adhere on the membrane surface firstly， and then competed with each other until the top community appeared.

anaerobic membrane bioreactor；membrane fouling；terminal restriction fragment length polymorphism；microbes community structure；biodiversity

X703.1

A

1000-6923（2015）01-0110-06

隋力新（1987-），男，辽宁铁岭人，哈尔滨工业大学硕士研究生，主要从事污水处理方面研究.

2014-04-19

国家自然科学基金（21177033）

* 责任作者， 教授， gaodw@hit.edu.cn