北运河沉积物中氨氧化微生物的群落特征

鲍林林，陈永娟，王晓燕，2*（.首都师范大学资源环境与旅游学院，北京 00048；2.首都师范大学首都圈水环境研究中心，北京 00048）

北运河沉积物中氨氧化微生物的群落特征

鲍林林1，陈永娟1，王晓燕1，2*（1.首都师范大学资源环境与旅游学院，北京 100048；2.首都师范大学首都圈水环境研究中心，北京 100048）

采用T-RFLP、RT-qPCR和克隆测序等分子生物学技术，以氨单加氧酶基因（amoA）为分子标记，研究了北运河表层沉积物中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）的群落多样性、丰度、系统发育及其与环境因子的响应关系.结果表明，沉积物中AOB的群落多样性和丰度均高于AOA，是北运河沉积物中氨氧化过程的主要功能微生物.沉积物中氨氧化微生物群落结构沿干流和支流存在明显的空间分异，而AOA的种类组成空间差异较小；沉积物的氨氮）和硝态氮）是影响氨氧化微生物群落特征的主要因子，AOB对环境变化的敏感性更高；AOA和AOB的amoA基因拷贝数分别为1.32×105～1.91×106copies/g、5.39×105～8.3×106copies/g.闸坝下游沉积物的氨氧化微生物丰度最高.系统发育分析表明，amoA基因序列多属于土壤/沉积物分支，较多AOB的克隆序列与土壤亚硝化螺菌属（Nitrosospira）的类群相似性可达98%.受污水处理厂退水的影响，部分amoA基因序列与污水处理厂废水和活性污泥中发现的类群同源性高.污染物质来源、支流汇入和闸坝拦截对河流沉积物氨氧化微生物的群落特征影响显著.

沉积物；amoA；群落结构；丰度；系统发育

每年有超过一半的氮固定由人类活动产生，大量活性氮输入生物圈，加剧了全球氮循环的氮负荷干扰了相应微生物的生态功能［1］.氨氧化作用（硝化过程的第一步）作为氮循环的关键限速步骤，是全球氮循环的中心环节，主要由功能微生物氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）所驱动［2-3］. AOA和AOB在不同的环境条件下，两者相对的群落结构、多样性、丰度和氨氧化效率优势不尽相同，并且受到pH值、、盐度和有机碳等环境因子的影响［4-6］.古菌和细菌对硝化过程的相对贡献率，是目前氮循环微生物生态学的研究重点，在大多数生态环境如土壤和海洋的氨氧化过程中AOA居主导地位［3，7］，但是AOA和AOB在淡水生态系统尤其是沉积物中的生态特征、功能差异及多样化环境要素的影响机制仍需要进一步的研究［8-9］.

北运河上游河段（沙河闸-杨洼闸）主要流经北京市北部和东部地区，流域范围覆盖了北京市城市化水平最高、人类活动最频繁的区域，周围环境受人类活动影响而变化剧烈［10］.作为北京市最主要的泄洪、排污河道，大量未经处理的工农业废水、城市生活污水以及污水处理厂的退水以点源或非点源的形式排入河道，导致水体氨氮含量严重超标［11-12］.河道水流缓慢导致沉积物大量淤积，而污染物质的沉降、吸附使得沉积物成为内源污染源，其中氮循环功能微生物的活性和氧化还原条件决定了过量氮素的有效转化和输出［13］，对北运河的水质改善具有重要作用.范改娜等［14］和张建伟等［15］在北运河岸边湿地和温榆河（北运河上游）沉积物中已分别发现，AOA和AOB的普遍存在.本研究利用分子生物学技术，对比研究了北运河沉积物中氨氧化微生物（AOA和AOB）的群落特征和系统发育，并对其与环境因子的响应关系进行定性和定量的分析，以探讨AOA和AOB在城市河流氨氧化过程中的作用和功能差异，为微生物参与氨氧化过程的调控作用和建立北运河生物地球化学循环模型提供理论基础，同时也为控制城市河流氮素污染、协调水生态平衡提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集

2013年7月，于北运河京区流域范围主干水系上进行实验样品的采集.沿途共设置5个样点，依次编号为1、2、3、4、5（图1）.样点设置考虑了水库、闸坝和支流汇入等影响河流水质的主要因素:位于沙河水库（水系上游区域）堤坝下游的1号点和杨洼闸（水系出京的最后关卡）闸门下游的5号点，位于水系主要支流（坝河和凉水河）汇入口的3、4号样点，以及位于马坊桥的2号点.每个样点分别采集上覆水和表层沉积物（3～5cm），沉积物用无菌袋封装，冷藏保存（4℃），运回实验室后-20℃冻存以备后续分子实验使用.

图1 采样点分布示意Fig.1 The distribution of sampling sites 1.沙河水库坝后；2.马坊桥；3.坝河口；4.榆林庄桥；5.杨洼闸后

1.2 样品理化分析

上覆水pH值由Mettler Toledo Delta 320pH计测定，溶解氧浓度（DO）采用取样现场进行硫酸锰和碱性试剂固定的碘量法（GB 7489-87）测定，总有机碳（TOC）和总氮（TN）使用Multi NC2100（Analytik Jena，德国）测定，氨氮、亚硝氮）和硝态氮）使用FIAstar流动注射分析仪（FOSS，丹麦）测定.

1.3 沉积物DNA提取及amoA基因PCR扩增

称取0.3g沉积物样品，采用Power Soil DNA试剂盒（MO BIO Laboratories Inc.，美国）进行样品DNA提取，作为PCR扩增的DNA模板.AOA和AOB的amoA基因PCR扩增反应体系为:DNA模版10 μL，前后引物各2μL，2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技，北京）25 μL，加双蒸水（ddH2O）到总体积为50 μL.PCR扩增引物和温度程序设置如表1所示.扩增产物用1%的琼脂凝胶电泳检测.用于末端限制性片段长度多态性技术（TRFLP）分析的PCR扩增产物，对前引物（ArchamoAF， amoA-1F）5’端进行FAM荧光标记.

表1 氨氧化微生物amoA基因PCR扩增引物和条件Table 1 Primers and procedures for PCR amplification of amoA genes

1.4 T-RFLP分析和RT-qPCR

利用T-RFLP进行氨氧化微生物群落结构分析［18］.按照TIANquick Mini Purification Kit纯化试剂盒（天根生化科技，北京）对PCR产物纯化回收后，采用限制性内切酶HhaⅠ（Takara宝生物工程有限公司，大连）进行酶切.反应体系（20μL）为:PCR纯化产物10μL，HhaⅠ酶1μL，10mol/L Buffer 2μL，ddH2O 7μL.37℃培养箱内酶切5h后，70℃水浴灭活15min，酶切产物由上海基康公司测定.

采用SYBR Green法，由ABI 7500FAST（Applied Biosystems， 美国）型荧光定量PCR仪进行amoA的绝对定量分析（实时荧光定量PCR，RT-qPCR）.样品amoA基因拷贝数的荧光定量测试由上海美吉生物医药科技有限公司完成.

1.5 克隆、测序及系统发育分析

用Gel Extraction Kit（OMEGA Bio-tek，美国）对PCR产物进行切胶纯化，将回收产物与pEASY-T1载体（北京全式金生物技术有限公司）进行连接，转入Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，在氨苄青霉素平板上培养后进行蓝、白斑筛选，并通过克隆检测引物进行菌液PCR，挑选出阳性克隆子送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序.返回序列经NCBI提交获取序列登陆号（AOA:KF856971-KF857161； AOB: KJ093846-KJ094018）后，利用DOTUR软件以2%的差异度划分独立操作单元（operational taxonomic unit，OTU）［19］，将代表序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，并选取已发表的氨氧化微生物amoA序列作为参比序列，使用MEGA 4软件以邻位相连法（Neighbor-Joining）构建系统发育树［20］.

1.6 数据分析

利用PRIMER 5.0对整理后的T-RFLP数据进行微生物群落的香农多样性指数（Shannon-Weiner， H’）和均匀度指数（E），以及各样点的相似性（Similarity）分析.计算公式如下:

式中:S为该样样点微生物群落T-RF片段总数；Pi= Ni/ N，为第i个T-RF片段的T-RFLP图谱峰面积（Ni）所占总峰面积（N）的百分比.

采用SPSS16.0和PRIMER 5.0对数据进行处理.氨氧化微生物群落与环境因子之间的关系采用Canoco for windows 4.5软件进行分析.

2 结果

2.1 沉积物及上覆水的理化指标

北运河的河道设有多道闸坝、橡胶坝等水利措施，水流平缓，沉积物淤积明显.由表2可见，各样点上覆水TN浓度均很高，其中以为主，高出Ⅴ类水质标准值4～8倍.和的浓度相对较低，闸坝后水体（沙河水库闸和杨洼闸）的浓度明显高于其他样点.上覆水pH＞7.5偏碱性，TOC浓度从上游到下游各点呈先增加后减少的趋势.各样点沉积物的pH值基本上低于上覆水，而沉积物中的与的浓度比明显高于上覆水中的比值，2号点沉积物的和含量最高.位于库坝、闸坝下游的1、5号样点，水流较快，沉积物泥沙含量明显高于其他样点，其TN和TOC含量也明显低于其他样点.沉积物的TN和TOC存在显著的正相关关系（P＜0.01）.总体看来，上覆水营养物质水平对沉积物具有一定的影响作用，而沉积物中氨氧化微生物对的转化效率可能更高.

表2 表层沉积物和上覆水的理化性质Table 2 Physicochemical properties of sediments and overlying waters

2.2 沉积物氨氧化微生物的多样性和丰度

如表3所示，每个T-RF片段至少代表一种微生物，北运河沉积物中共检出33种不同的AOA和44种不同的AOB，总体来看，北运河沉积物AOB的多样性高于AOA.均匀度指数和多样性指数变化一致，5号点（杨洼闸）的氨氧化微生物种数最少，且amoA的均匀度和多样性最低；4号点（榆林庄桥）的AOA多样性最高，2号点（马坊桥）的AOB多样性最高，3、4号点AOA多样性较高于AOB.

表3 氨氧化微生物amoA的T-RFs和多样性Table 3 The terminal fragments of amoA genes and the calculated diversity indices

图2 各样点主要T-RFs的相对含量Fig.2 The relative abundance of the dominant T-RFs in each sediment

图2所示为5个样点沉积物氨氧化微生物主要种类（T-RF百分含量大于6）的组成状况.AOA的优势菌种比较突出，主要为分布在1、2、5号点的169bp和3、4号点的116bp.AOB优势菌的种类数较多，包括74，65，474，106bp等，且各样点之间T-RFs组成的差异性较大，可见，北运河沉积物中AOB比AOA具有更高的生物多样性.利用PRIMER 5.0对各样点氨氧化微生物的T-RFs组成进行Similarity聚类分析，5个沉积物的AOA和AOB群落均被主要聚为两大类:位于水系干流的1、2、5号样点和位于支流入汇处的3、4号样点.其中2、5号样点AOA群落组成的相似性高达81%，1号与2、5号AOA的相似性约70%，而位于支流的3、4号样点AOA群落相似性也有57%；而AOB相似性最高的样点3、4号也仅53%，可见，各样点AOA的群落组成相似性较高，AOB的空间差异大，群落组成多样性更高.

图3 各样点氨氧化古菌和细菌amoA基因拷贝数Fig.3 Abundances of archaea and bacterial amoA genes in each sediment

RT-qPCR分析沉积物氨氧化微生物的丰度结果如图3所示.AOA和AOB的amoA拷贝数分别为1.32×105～1.91×106copies/g、5.39×105～8.3×106copies/g，细菌amoA的拷贝数是古菌的2～11倍，AOB的丰度高于AOA.1、5号样点的amoA拷贝数明显高于其他样点，且1号点的amoA拷贝数最高，AOB的丰度也最高，4号点（榆林庄桥）的氨氧化微生物丰度最低，氨氧化微生物的丰度主要受细菌amoA拷贝数的影响（R2= 0.99，P ＜ 0.01）.细菌和古菌的amoA占总amoA的比例为极显著的负相关关系（P ＜ 0.01），AOA、AOB在北运河沉积物中的群落生长表现为一定的竞争关系.

2.3 环境因子与微生物群落结构的相关分析

利用Canoco选择合适的分析模型，根据物种的排序结果，对AOA优势种与沉积物环境理化因子的关系进行冗余分析（RDA），AOB优势种与环境因子的关系进行典范对应分析（CCA）分析（图4）.

图4 各样点优势种与沉积物环境因子的关系Fig.4 The correlation analysis of the dominant T-RFs with sediment environmental factors

图5 古菌amoA基因序列的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of representative archaeal amoA sequences and reference sequences from GenBank

图6 细菌amoA基因序列的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of representative bacterial amoA sequences and reference sequences from GenBank

如图4所示，各沉积物样点受环境因子影响的AOA和AOB群落结构明显分为两类:干流（1、 2、5号样点）和支流（3、4号样点），与Similarity分析结果一致.AOA优势种与环境因子的RDA结果显示，排序轴AX1和AX2的解释度分别为85.5%、8.7%，氨氮占总氮的比例（-0.9927）、氧化态氮占总氮的比例（-0.8351）和）与AX1的相关性较高与AX2的相关性较高.CCA分析沉积物AOB优势种与环境因子的结果表明，排序轴AX1、AX2和AX3的解释度分别为48.3%、20.9%和18.6%，与AX1相关性高的环境因子有）、）、）和，与AX2相关性较高的环境因子为TOC/TN（0.8198，）与AX3相关性较高的环境因子有）、TN（0.6857）和pH（-0.6584）.总体而言，沉积物TN中、所占比例和的含量是影响氨氧化微生物群落结构的主要因素，且AOB群落结构受多种环境因子的影响，其对环境变化的敏感性比AOA高.

2.4 沉积物氨氧化微生物的系统发育分析

如图5所示，沉积物中AOA的amoA基因序列在系统发育树中可划分为3个分支，其中52.5%的序列属于第Ⅰ分支，与海岸带沉积物及农业土壤AOA的亲缘关系较近；第Ⅱ个分支包括了8.1%的主要来自1号样点的克隆序列，与崇明岛东潮滩沉积物的序列（JQ345811）相似度高达99%.其余39.5%的克隆序列属于第Ⅲ个分支，与饮用水和污水处理厂水样中的古菌amoA序列同源性较高.此外，1号样点amoA序列在3个分支均有分布，2号样点主要属于第Ⅲ个分支，而3号样点仅分布于第Ⅰ分支.综上所述，北运河沉积物AOA的系统发育主要属于土壤/沉积物分支类群，又因其高污染的环境特点，部分序列与污水处理厂类群的亲缘性较高，主要包括2号点（马坊桥）的相关序列，可能与该处强烈人类活动（集市，多生活固体废弃物）影响有关.

北运河沉积物中AOB的amoA序列也主要划分为3个分支（图6），第Ⅰ个分支包括了45%的序列，主要与土壤amoA的序列亲缘关系较近，该分支主要包括3和5号样点的克隆序列，其中序列5b30与来自森林土壤［21］的Nitrosospira sp. LT2MFa（AY189145）相似性88%，序列5b10与来自农田土壤［22］的Nitrosospira sp. Np39-19（AF042170）相似性高达98%，该分支与亚硝化螺菌属（Nitrosospira）类群密切相关；12.4%的序列（来自1号点）属于第Ⅱ分支，与污水处理厂污泥中AOB类群相似性极高；第Ⅲ个分支与河口、湖泊沉积物的AOB类群相似，包括42.6%的测试序列，2号样点所有代表序列从属于该分支.

3 讨论

3.1 群落特征与环境因子的响应关系

已有研究表明，在很多环境中AOA的群落特征和功能作用均优于AOB，且AOA的多样性具有明显的环境来源特性，是驱动氨氧化过程的主要微生物［13，23］，如在海洋生态系统和土壤环境中古菌amoA基因比细菌的相对丰度高3000～8000倍［24-25］，淡水中AOA比AOB更适于厌氧或低氨氮浓度条件［26-27］.但是，在红树林沉积物［17］、河流沉积物［28］以及氨氮污染严重的湿地（潮滩）［29］中AOB的群落丰度更具优势，除氮反应器活性污泥中的AOB群落多样性和丰度均高于AOA，且AOB对环境变化的敏感性比AOA高［30］，本文针对amoA基因的T-RFLP和RT-qPCR实验分析也得到相似的结果，沉积物中AOB的种类数多于AOA，其中AOA的优势种类主要为169bp和116bp，AOB的优势种类包括74，56，474，106bp等，总体来看AOB的多样性高于AOA.沉积物中AOB的群落丰度也高于AOA，细菌amoA的拷贝数是古菌的2～11倍，总amoA基因拷贝数与AOB丰度显著相关，由此可见，AOB可能是北运河沉积物中氨氧化过程的主导微生物.

北运河沉积物中AOB的主要类群（分支Ⅰ，45%的amoA序列）可能属于亚硝化螺菌属（Nitrosospira）.而在GenBank数据库中没有发现纯培养的AOA已知菌种与北运河沉积物的amoA基因序列有较近发育关系.沉积物中大部分的AOA类群与土壤/沉积物来源的菌种相似性较高，AOA的系统发育可能与奇古菌Group I.1b类群密切相关［2］.此外，部分amoA基因序列与污水处理厂的废水［39］、活性污泥［40］中的类群有良好的亲缘关系，这与北运河接纳大量污水处理厂退水有关，通常污水处理厂退水中除了大量的有机质和营养元素外，还带有很多特有的微生物，对河流的水质状况和微生物系统具有很强的扰动（如微生物物种的殖民）［41-42］.

3.2 氨氧化微生物的空间分异

本研究涉及的5个沉积物样点，对AOA和AOB群落结构进行Similarity聚类分析，结果可分为1、2、5号和3、4号两类，其中，3、4号样点分别位于支流坝河和凉水河的入汇处，污水处理厂退水的影响强烈的主要补给来源为再生水和污水混合类， 1、2、5号样点位于水系干流上主要来源于再生水水源［10］.此外，位于上游河段的1、2号样点沉积物中的AOB种类数明显高于AOA，而来自支流（坝河、凉水河）沉积物中的AOA种类数更多，到下游干流的5号样点，受支流汇入的影响，沉积物中AOA种类数明显多于AOB，可见，水系中不同点位主要污染物质的来源不同，氨氧化微生物的群落结构也表现出相应的空间分异，且支流汇入对河流沉积物群落组成的影响作用显著.

荧光定量分析（图3）发现位于河道闸坝后的1号（沙河水库坝后）和5号（杨洼闸后）样点的amoA基因拷贝数明显高于其他样点，Spearman相关性分析表明，总的amoA基因丰度与沉积物的TN、TOC含量呈显著负相关（P ＜ 0.05），与含量也存在一定的负相关关系，闸坝后的上覆水和沉积物中TN、TOC含量也明显低于其他样点，杨洼闸后的浓度也相对较低，这可能是由于闸坝频繁开启扰动水体有益沉积物微生物增长，而促进了氨氧化微生物的丰度发育和营养物质的转化，同时库坝内相对稳定的环境有利于营养物质的沉降、截留［11］，Wall等［43］通过对Kaskaskia河上的Shelbyville水库（美国）内营养物质转化和微生物作用的研究也表明，河流水库库区对水体营养物质的拦截和沉积物中微生物的功能作用，对库区下游水生态系统具有积极作用.北运河主河道和支流沿途都设有多道水闸、橡胶坝等水利调控设施，具有一定的拦洪、拦污作用，并明显地影响着沉积物氨氧化微生物的群落结构和空间分布，以及河流营养物质的转化效率.

4 结论

4.1 北运河沉积物中AOB的群落多样性高于AOA.由于支流汇入和不同污染物质来源的影响，干流和支流沉积物氨氧化微生物群落结构存在明显分异，各样点之间AOA的组成相似性较高，AOB的群落分布空间差异较大.

4.3 北运河沉积物中氨氧化微生物的主要类群属于土壤/沉积物分支，其中，AOB与土壤亚硝化螺菌属（Nitrosospira）的相似性较高，受污水处理厂退水影响，部分amoA基因序列与污水处理厂废水和活性污泥中发现的类群同源性强.可见，污染物质来源、支流汇入和闸坝拦截对河流沉积物氨氧化微生物的群落特征具有很大的影响作用.

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Diversity and abundance of ammonia-oxidizing prokaryotes in surface sediments in Beiyun River.

BAO Lin-lin1，CHEN Yong-juan1， WANG Xiao-yan1，2*（1.College of Resources， Environment and Tourism， Capital Normal University，Beijing 100048， China；2.Research Center of Aquatic Environment in the Capital Region， Capital Normal University，Beijing 100048， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：179～189

The community diversity， abundance， and phylogeny of ammonia-oxidizing archaea （AOA） and bacteria （AOB）in the surface sediments of Beiyun River were investigated using various molecular techniques targeting the ammonia monooxygenase （amoA） genes. Diversity and abundance of bacteria were higher than those of archaea. AOB were the dominant ammonia-oxidizing microorganisms in Beiyun River. For AOB， sediment samples from main stream and tributary were cluster into two categories. In contrast， AOA communities showed relatively slight site-specific difference. Correlation analysis indicated that concentration of ammonia） and the sum of nitrite and nitrate of sediment were the main factors affecting the community compositions of ammonia-oxidizing prokaryotes， and AOB was much more sensitive to environmental change. The amoA gene copy numbers of AOA and AOB in wet sediment ranged from 1.32×105to 1.91×106copies/g and from 5.39×105to 8.3×106copies/g， respectively. The sediment ammonia-oxidizing prokaryotes in downstream of the dam showed the highest abundance. Phylogenetic analysis revealed that most of the cloned amoA sequences of both AOA and AOB belonged to soil/sediment group. A considerable proportion of AOB sequences were highly affiliated with soil Nitrosospira lineage. Because of the influence from wastewater treatment plant effluent， some amoA sequences were similar to those recovered from activated sludge and wastewater.

sediment；amoA；community composition；abundance；phylogeny

X172

A

1000-6923（2015）01-0179-11

鲍林林（1990-），女，四川绵阳人，首都师范大学资源环境与旅游学院硕士研究生，主要从事生态环境治理与建设研究.发表论文8篇.

2014-04-28

国家自然科学基金项目（41271495）；高等学校博士学科点专项科研基金联合资助项目（20121108110006）

* 责任作者， 教授， cnuwxy@sohu.com