典型纳米金属氧化物对氨氧化菌Nitrosomonas europaea的生物胁迫影响

刘美婷，余 冉*，陈良辉，吴俊康（1.东南大学能源与环境学院，江苏 南京 210096；2.东南大学无锡太湖水环境工程研究中心，江苏 无锡 214135）

典型纳米金属氧化物对氨氧化菌Nitrosomonas europaea的生物胁迫影响

刘美婷1，2，余 冉1，2*，陈良辉1，2，吴俊康1，2（1.东南大学能源与环境学院，江苏 南京 210096；2.东南大学无锡太湖水环境工程研究中心，江苏 无锡 214135）

对比研究了3种典型纳米金属氧化物颗粒（NPs，包括纳米TiO2（n-TiO2），纳米CeO2（n-CeO2）和纳米ZnO（n-ZnO））在不同作用浓度下（0，0.1，1，10，50mg/L）对污水生物脱氮系统中代表性氨氧化菌— Nitrosomonas europaea连续作用6h的毒性效应及作用规律.结果表明，3种NPs对N.europaea的生物胁迫效应与其投加浓度均呈正相关.其中，50mg/L的n-CeO2， n-ZnO与对照组相比，可显著降低N.europaea细菌浓度，破坏细胞膜完整性，抑制氨氧化速率.相同浓度条件下， n-ZnO对N.europaea的毒性影响最大， n-TiO2影响最小.虽然n-ZnO释放的Zn2+对N.europaea具有明显的毒性效应，但n-ZnO及其产生的尺寸效应仍是其生物胁迫产生的重要来源.

纳米颗粒；氨氧化菌；生物毒性

纳米颗粒（NPs）由于其独特的物理化学性质被广泛应用于医药、催化、食品、化妆品、环境污染治理等领域［1］.但NPs独特的小尺寸效应与高表面活性使其易产生与常规尺寸物质不同的毒性效应或导致毒性效应放大［2］.NPs的生物安全性已受到越来越广泛的关注［3-4］.

NPs的大量使用导致其在生产、使用、处置过程中不可避免地通过污水收集管网进入市政污水处理厂［5-6］，欧洲地区水环境中n-ZnO浓度可达到0.432mg/L，美国10处代表性污水处理厂进水中n-TiO2浓度范围为181～1233μg/L［7］. NPs进入污水处理厂会对污水处理系统产生潜在威胁. 50mg/L纳米TiO2（n-TiO2）进入序批式生物反应器会显著降低总氮去除效率、改变活性污泥生物种群结构并降低其生物多样性［8］；1mg/L纳米ZnO（n-ZnO）和纳米Ag冲击负荷均对生物硝化反应活性具有抑制作用［4，9］.但迄今为止，针对纳米污染物对污水脱氮工艺限速步骤—氨氧化过程的影响研究还较少，对在氨氧化过程中起关键作用的微生物菌团毒性作用及其影响机理仍缺乏系统性研究［5，9］.因此，本文选取3种已被广泛应用，并且已证实存在于污水处理系统中的纳米金属氧化物—即n-TiO2、纳米CeO2（n-CeO2）、n-ZnO为研究对象， 以污水生物脱氮系统中典型又广泛存在的氨氧化菌—欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）作为受试对象，考察具有不同化学组成、带电性、与溶解度等特性的NPs对N.europaea在生理生化水平上的短期作用影响，研究其毒性作用规作用规律，对比不同NPs生物胁迫效应的差异，并探讨其相关影响机理， 为进一步研究NPs对污水脱氮处理工艺的作用影响与作用机制提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 NPs与表征

n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO购自美国Sigma公司，纯度＞99.7%.利用扫描电子显微镜（JSW-7600F，日本电子株式会社）观察粉状NPs的形态.利用马尔文纳米激光粒度仪（Zetasizer Nano ZS90，英国Malvern公司）检测经超声（17w，20min）处理、溶于超纯水的NPs 动态光散射粒径及Zeta电位.

1.2 N.europaea细胞培养

将N.europaea（ATCC19718）菌种（由中国科学院城市环境研究所于昌平教授课题组提供）置于稳定运行的恒流生物反应器中培养（28℃、pH（7.45±0.02）、水力停留时间2.2d、溶解氧浓度（1.80±0.10）mg/L），培养液配制参考Fang等［10］研究.进水氨氮）设计浓度为280mg/L.

1.3 NPs对N.europaea短期暴露试验

取恒流生物反应器稳定生长的N.europaea菌液各300mL，分别投加经高温灭菌及超声分散均匀的n-TiO2、n-CeO2或n-ZnO至NPs最终浓度分别为0（对照组），0.1，1，10，50mg/L.同时投加经高温灭菌的（NH4）2SO4溶液至最终投加浓度为50mg/L.针对n-ZnO溶解度高的特点，通过预实验测定50mg/L n-ZnO对N.europaea作用6h后释放的Zn2+浓度为（3.4±0.2）mg/L，故另取300mL菌液，投加ZnSO4至Zn2+最终浓度为3.4mg/L作为Zn离子毒性作用对比组.菌液与NPs在28℃、120r/min的水浴恒温振荡器内避光混合培养6h后取样分析.

1.4 测定指标与方法

1.2.5 Western blot检测移植瘤组织中PCNA、survivin、CDK4、p21蛋白表达 取1.2.4中收集的肿瘤组织，检测组织中PCNA、survivin、CDK4、p21蛋白表达水平，以Western blot方法检测，步骤同1.2.3。

N.europaea菌种与NPs混合液DLS粒径、Zeta电位采用马尔文纳米激光粒度仪测定.细菌浓度采用直接计数法于显微镜（OLYMPUSBX41，日本OLYMPUS公司）下计数获得.选用LIVE/DEAD®BaclightTWBacterial Viability荧光染料（美国Life technologies公司）测定N.europaea细胞膜受损状况.氨氮浓度测定选用水杨酸-次氯酸盐光度法，亚硝态氮浓度测定选用N-（1-萘基）-乙二胺光度法.Zn2+测定选用火焰原子吸收分光光度法.

1.5 统计学分析

每一设计实验均进行了平行重复实验验证，每一样品的各项指标均平行测定2次.文中试验结果均以2次重复试验的数据平均值±标准差表示，采用SPSS Statistics统计软件进行T检验差异性分析，当P＜0.05时表示有显著性差异.

2 结果

2.1 NPs表征

经SEM扫描分析显示（图1），n-TiO2、n-CeO2近似球状、大小较均匀， n-ZnO粒子形态呈不规则方形、粒径较不均匀.通过在电镜不同视野下各随机选取200个颗粒进行粒径的人工测定与统计，得到n-TiO2、n-CeO2平均粒径分别为（41±10）nm和（35±11）nm， n-ZnO长度方向平均粒径为（95±24）nm.考虑到NPs颗粒间的团聚作用及外界介质对颗粒的可能影响，本文利用动态光散射技术测定n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO在超纯水中的DLS粒径分别为（187±69）nm、（509± 119）nm和（285±43）nm. Zeta电位检测显示n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO在水中分别呈负电性［（-26.7±11.1） mV］、弱负电性［（-6.4±3.6） mV］、和正电性［（16.2±2.91） mV］.

2.2 NPs对菌液粒径的影响

图2显示了NPs与N.eureopaea菌液混合作用后混合液颗粒粒径的变化规律.与纯菌液对照组相比，混合液颗粒平均粒径均与NPs浓度呈正相关性增大.50mg/L n-TiO2、n-ZnO、n-CeO2的加入分别导致混合液粒径与纯菌液相比显著增大了（69.7±15.7）%、（92.4±18.1）%和（99.4±19.8）%.鉴于对照组中N.europaea细胞直径为（828.2± 83.6）nm，NPs可能吸附于细菌表面或导致了细胞变形.n-CeO2的浓度达到10mg/L以上时，对混合液粒径的影响程度略高于其他2种NPs，这可能与n-CeO2本身在溶液中的DLS粒径较大有关.

图1 NPs的SEM图谱Fig.1 SEM images of NPs

2.3 NPs对菌液Zeta电位的影响

图2 NPs对混合液粒径的影响Fig.2 Impacts of NPs on the size of particle-cell complex

图3 NPs对混合液Zeta电位的影响Fig.3 Impacts of NPs on the Zeta potential of particle-cell complex

2.4 NPs对N.europaea细胞膜的影响

细胞膜是NPs接触细胞的第一道屏障，细胞膜的受损状况可以反映出NPs作用于细胞的早期胁迫影响.图4显示， N.europaea细胞膜未受损细胞占总细胞的比例随3种NPs投加浓度的增大均呈现降低趋势，其中50mg/L n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO以及10mg/L n-ZnO组的细胞膜未受损细胞比例明显低于对照组（P＜0.05），分别降低了（2.8±0.9）%、（4.5±0.9）%、（6.5±0.6）%和（5.4±0.8）%.n-ZnO在各试验作用浓度下对N.europaea细胞膜的损伤程度均明显高于其它两种NPs.n-CeO2对细胞膜的损伤影响则稍高于n-TiO2. 50mg/L n-ZnO对细胞膜的损伤程度显著高于其对应Zn2+（3.4mg/L）对细胞膜的影响程度，其结果预示，n-ZnO及其尺寸效应可对细胞细胞膜产生重要胁迫损伤.

图4 NPs对N.europaea细胞膜完整性的影响Fig.4 Impacts of NPs on the membrane integrity of N.europaea

2.5 NPs对N.europaea细菌浓度的影响

图5 NPs对细菌浓度的影响Fig.5 Impacts of NPs on cell density

3种NPs的投加均导致N.europaea细菌浓度降低，并呈现明显的剂量—效应相关关系（图5）.50mg/L n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO以及10mg/L n-ZnO组的细菌浓度分别较对照组显著下降了（27.3±12.4）%、（34.1±15.8）%、（48.4±15.4）%和（34.2±14.5）%.n-TiO2和n-CeO2对N.europaea细菌浓度的影响相近且较小.n-ZnO在各作用浓度下对细菌浓度的影响最大，在50mg/L浓度条件下，与受相同浓度n-TiO2和n-CeO2影响的细菌浓度存在显著差异.受Zn2+影响的细菌浓度较对照组下降了（39.6±15.9）%，但与50mg/L n-ZnO的结果无显著差异.

2.6 NPs对N.europaea氨氧化速率的影响

N.europaea好氧状态下在氨单加氧酶（AMO）催化作用下将氨（NH3）氧化为羟胺（NH2OH），同时羟胺在羟胺还原酶（HAO）催化作用下迅速氧化为亚硝酸根［11］.鉴于氨氮在试验不断搅拌条件下的挥发影响，本文依据实验过程中亚硝态氮的平均生成速率的测定，分析讨论NPs胁迫影响下N.europaea氨氧化速率的变化规律.

图6显示在3种NPs不同浓度作用条件下，N.europaea氨氧化速率随NPs浓度的增加均呈现持续降低趋势.受不同浓度n-TiO2影响的氨氧化速率与对照组相比均无显著差异，表明n-TiO2在本文试验浓度范围内短期6h作用于N.europaea对其氨氧化速率影响较小.n-CeO2和n-ZnO在50mg/L浓度时， N.europaea的氨氧化速率明显减缓，其抑制率分别为 （33.3±6.1）%和（60.0±9.4）%.n-ZnO对细胞氨氧化速率影响在3种NPs中最大，并呈现显著的浓度抑制效应.同时，50mg/L n-ZnO组氨氧化速率显著低于其对应Zn2+试验组，其结果表明了n-ZnO及其尺寸效应在n-ZnO生物毒性作用中的重要地位.

图6 NPs对氨氧化速率的影响Fig.6 Impacts of NPs on ammonia oxidation rate

3 讨论

目前，对NPs毒性机制的研究主要集中在氧化胁迫和细胞膜损伤两方面.研究发现，n-TiO2和n-ZnO均能穿透细菌细胞膜，到达细胞内部，产生高活性氧分子（ROS），造成细胞损伤甚至凋亡［12］. n-CeO2毒性机制研究目前主要集中于真核细胞，对细菌等原核生物的研究较少.如n-CeO2能够诱导与氧化胁迫有关的基因表达，导致人正常肺上皮细胞中ROS 浓度升高、谷胱甘肽活性增高，从而导致细胞死亡［13］.在本研究中，NPs作用下N.europeae氨氧化速率的抑制与细菌浓度的降低可能与NPs诱导下细胞体内ROS大量产生密切相关.细胞膜可以维持细胞内稳定的代谢环境，同时调节和选择进出细胞的营养物质，是外界接触细胞的第一道屏障.很多研究者［10，14-15］都观察到n-CeO2、n-ZnO等可与细菌细胞直接接触，并改变细胞膜粘滞性，增加细胞膜渗透性，导致细胞形态发生改变、NPs在细胞膜上积累甚至进入胞内，从而对细胞造成毒性损伤.本研究发现，NPs作用下混合液粒径与Zeta电位的显著变化也预示了NPs与细胞密切接触.同时高浓度（如50mg/L）n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO投加的影响也证实了NPs可破坏N.europeae细胞膜完整性.但根据Fang等［10］研究发现，纳米颗粒与N.europaea短期作用4h后，纳米颗粒已经进入细胞内部，此时细胞发生形态改变，但并无明显的细胞膜破损现象，因此纳米颗粒的毒性影响可能会首先体现在细胞酶活性抑制上从而造成氨氧化速率的降低，甚至影响细胞的新陈代谢过程从而降低细胞生长速率.

本研究发现，n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO对N.europeae存在不同程度的生物胁迫影响，表明NPs的毒性还与其本身的物理化学性质存在密切关系.n-TiO2的作用机理可能与其小颗粒粒径及高效光催化活性有关［16-17］.在本研究的3种NPs中，n-TiO2的DLS粒径最小，比表面积最大，表面活性也最强，因此可能更易于向细胞周围聚集和吸附［17］.n-TiO2的光催化活性，使其在能隙带能量或其能级以上发生光激发现象更容易促进ROS的产生，造成氧化胁迫，损伤细胞［12，18］.因本研究避光进行，故可排除n-TiO2光催化活性影响，其6h短期毒性影响在本研究的3种NPs中也最不显著.n-CeO2的毒性作用可能与其自身的氧化作用有关，Thill等［14］认为n-CeO2可以吸附在大肠杆菌细胞表面氧化细胞组分，甚至产生与ROS引起的氧化胁迫不同的脂质过氧化反应，从而对细胞造成损伤.

n-ZnO的表面电荷性及溶解度可能是导致其生物毒性在3种NPs中最高的原因.带正电荷的n-ZnO和带负电荷的N.europeae细菌间可能产生较强的静电引力，使其更容易吸附到细菌表面，直接与细菌接触，从而造成对细胞膜更大程度的损伤［19］.本研究中受n-ZnO作用后，菌液粒径增加和Zeta电位下降也间接证明了此观点. Feris等［20］研究发现，可以通过调整n-ZnO与4种基因型相同、带电荷不同的铜绿假单胞菌株之间的静电吸附作用来改变n-ZnO对其产生的毒性作用程度.另外，n-ZnO溶解释放的Zn2+可能与细胞膜或胞内的蛋白及核酸结合，从而抑制细胞正常的新陈代谢，增强n-ZnO的生物毒性.如Frallklin等［21］发现，n-ZnO对绿藻的毒性主要来源于Zn2+；Li等［19］发现，n-ZnO对大肠杆菌的毒性作用主要来源于自由态的Zn2+和不稳定的锌复合物.本文比较了50mg/L n-ZnO与对应其6h溶解度的Zn2+的毒性作用影响发现，n-ZnO对N. europeae细胞膜损伤及氨氧化速率抑制程度明显高于Zn2+实验组，但两者对细菌浓度的影响无显著差异.因此可以推测在短期毒性试验中，溶解的Zn2+虽可引起n-ZnO毒性胁迫影响，但n-ZnO及其尺寸效应也是其生物毒性作用产生的重要原因之一.

本研究的3种NPs在10mg/L以上的浓度条件下，经过6h短期作用，均对污水处理系统中典型而普遍存在的N.europeae产生了生物胁迫效应.鉴于NPs应用的日趋广泛性及在反应器内的长期累积潜在影响， NPs对生物除氮工艺的作用规律与影响机制需要更深入与系统的研究.

4 结论

NPs的6h短期作用即可对N.europeae产生明显生物胁迫影响，其投加浓度与毒性效应呈正相关性.相同NPs作用浓度下，n-ZnO对N.europaea的毒性影响最大， n-TiO2影响最小.鉴于50mg/L n-ZnO对细胞膜损伤及氨氧化抑制程度明显高于其对应溶解度下Zn2+在相同作用条件下对细胞的毒性影响，故推测n-ZnO本身及其产生的尺寸效应仍是n-ZnO的主要作用机制来源.

［1］雷静静，冯 佳，谢树莲.纳米氧化镍对3种绿藻的毒性效应 ［J］.中国环境科学， 2013，33（10）:1842-1849.

［2］Grazyna Bystrzejewska-Piotrowska， Jerzy Golimowski， Pawel L. Urban.Nanoparticles:Their potential toxicity， waste and environmental management ［J］. Waste Management， 2009，29: 2587-2595.

［3］Zhang Xiaoqiang， Yin Lihong， Tang Meng， et al.ZnO， TiO2， SiO2， and Al2O3Nanoparticles-induced Toxic Effects on Human Fetal Lung Fibroblasts ［J］. Biomed. Environ. Sci.， 2011，24:661-669.

［4］陈 铮，罗专溪，邱昭政，等.纳米金、银对氨氧化细菌及其氨氧化作用的影响 ［J］. 中国环境科学， 2014，34（3）:705-712.

［5］Satinder K Brar， Mausam Verma， Tyagi R D， et al. Engineered nanoparticles in wastewater and wastewater sludge - Evidence and impacts ［J］. Waste Management， 2010，30:504-520.

［6］Liu Y， Tourbin M， Lachaize S， et al. Nanoparticles in wastewaters hazards， fate and remediation ［J］. Powder Technology， 2014，255:149-156.

［7］Kiser M A， Westerhoff P， Benn T， et al.Titanium nanomaterial removal and release from wastewater treatment plants ［J］. Environmental Science and Technology， 2009，43:6757-6763.

［8］Zheng Xiong， Chen Yinguang， Wu hui.Long-term effects of titanium dioxide nanoparticles on nitrogen and phosphorus removal from wastewater and bacterial community shift in activated sludge ［J］. Environmental Science and Technology， 2011，45（17）:7284-7290.

［9］Liang Zhihua， Atreyee Das， Hu Zhiqiang.Bacterial response to a shock load of nanosilver in an activated sludge treatment system［J］. Water Research， 2010，44（18）:5432-5438.

［10］Fang Xiaohua， Yu Ran， Li Bingquan， et al. Stresses exerted by ZnO， CeO2and anatase TiO2nanoparticles on the Nitrosomonas europaea ［J］. Journal of Colloid and Interface Science， 2010，348: 329-334.

［11］Alan B Hooper， Todd Vannelli，David J. Bergmann. Enzymology of the oxidation of ammonia to nitrite by bacteria ［J］. Antonie van Leeuwenhoek， 1997，71:59-67.

［12］Ashutosh Kumar， Alok K Pandey， Shashi S Singh， et al. Engineered ZnO and TiO2nanoparticles induce oxidative stress and DNA damage ［J］. Free Radical Biology and Medicine， 2011， 51:1872-1881.

［13］Michael A Horton， Abid Khan.Medical nanotechnology in the UK: a perspective from the London Centre for Nanotechnology ［J］. Nanomedicine: Nanotechnology， Biology and Medicine， 2006， 2（1）:42-48.

［14］Antoine Thill， Ophelie Zeyons， Olivier Spalla， et al. Cytotoxicity of CeO2nanoparticles for Escherichia coli. physico-chemical insight of the cytotoxicity mechanism ［J］. Environmental Science and Technology， 2006，40:6151-6156.

［15］Ophelie Zeyons， Antoine Thill， Frnck Chauvat， et al. Direct and indirect CeO2nanoparticles toxicity for Escherichia coli and Synechocystis ［J］. Nanotoxicology， 2009，3（4）:284-295.

［16］Laura K Adams， Delina Y Lyon， Pedro JJ Alvarez. Comparative eco-toxicity of nanoscale TiO2， SiO2， and ZnO water suspensions［J］. Water Research， 2006，40:3527-3532.

［17］Damjana Drobne， Anita Jemec， Ziva Pipan Tkalec. In vivo screening to determine hazards of nanoparticles:Nanosized TiO2［J］. Environmental Pollution， 2009，157:1157-1164.

［18］David Jassby， Jeffrey Farner Budarz， Mark Wiesner.Impact of aggregate size and structure on the photocatalytic properties of TiO2and ZnO Nanoparticles ［J］. Environmental Science and Technology， 2012，46:6934-6941.

［19］Li Mei， Zhu Lizhong， Lin Daohui.Toxicity of ZnO Nanoparticles to Escherichia coli Mechanism and the Influence of Medium Components ［J］. Environmental Science and Technology， 2011，（45）:1977-1983.

［20］Feris K， Otto C， Tinker J， et al. Electrostatic interactions affect nanoparticle-mediated toxicity to gram- negative bacterium Pseudomonas aeruginosa PAO1 ［J］. Langmuir， 2009，26（6）: 4429-4436.

［21］Franklin N M， Rogers N J， Apte S C， et al. Comparative toxicity of nanoparticulate ZnO， bulk ZnO， and ZnCl2to a freshwater microalga （Pseudokirchneriella subcapitata）: the importance of particle solubility ［J］. Environmental Science and Technology， 2007，41（24）:8484-8490.

Biological effects of typical metal oxide nanoparticles on Nitrosomonas europaea.

LIU Mei-ting1，2， YU Ran1，2*， CHEN Liang-hui1，2， WU Jun-kang1，2（1.School of Energy and Environment， Southeast University， Nanjing 210096， China；2.Wuxi Engineering Research Center of Taihu Lake Water Environment， Southeast University， Wuxi 214135， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：190～195

The biotoxicities and impact patterns of three widely used nanoparticles （NPs） TiO2， CeO2and ZnO （n-TiO2，n-CeO2and n-ZnO） on the typical ammonia oxidizing bacteria， Nitrosomonas europaea were investigated. N.europaea was exposed to the NPs at a series of concentrations （0， 0.1， 1， 10， 50mg/L） for 6h. The effects of NPs on N.europaea were positively correlated with the exposed NP concentrations and the 50mg/L n-CeO2and n-ZnO significantly impaired the cell membrane integrity， cell density， and ammonia oxidization rate. n-ZnO showed the highest biotoxicity among the three NPs while n-TiO2showed the least. n-ZnO with its nano-size was considered to induce the serious nanotoxicities on N.europaea although the Zn2+dissolved from n-ZnO also contributed to n-ZnO toxicty.

nanoparticles；ammonia oxidizing bacterium；biotoxicity

X503.2

A

1000-6923（2015）01-0190-06

刘美婷（1989-），女，山东济南人，东南大学能源与环境学院硕士研究生，主要从事水污染控制研究.

2014-05-03

国家自然科学基金资助项目（51208092）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2012124）；国家教育部博士学科点专项科研基金资助项目（20120092120010）

* 责任作者， 副教授， yuran@seu.edu.cn