苁蓉菟丝子煎剂对长期大强度运动大鼠卵巢形态结构的影响

付 燕，熊若虹，袁琼嘉，李 雪

1.Chengdu Sport University，Chengdu Sichuan 610041;2.Southwest University for Nationalities，Chengdu Sichuan 610041

运动性月经失调是女运动员因长时间超负荷运动而引起的一种运动性病症。研究发现它不仅与女运动员的生殖功能下降有关，而且与心血管疾病、骨质疏松等病症也紧密相关［1-8］，严重影响到女运动员的竞技水平与身心健康。因此，如何防治运动性月经失调受到越来越多的国内外有关学者的关注和重视。国内有许多学者尝试运用祖国传统中医药方法如中药制剂、针灸等对运动性月经失调进行防治，并显示出它的潜力［9-11］。但是，关于其具体作用机制目前研究较少，没能提供充分的科学依据，使其不能得到有效推广。本课题应用中药苁蓉菟丝子煎剂对长期力竭游泳运动大鼠进行干预，借助HE染色、透射电镜等技术观察苁蓉菟丝子汤干预下长期力竭运动大鼠卵巢形态结构的变化，探讨该方剂对运动性月经失调的预防效果及作用机制。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级3月龄健康雌性 SD大鼠36只，体重206.21±15.12g，未曾交配，购自成都中医药大学实验动物研究中心，实验动物许可证:SYXK(川)2012-179。大鼠常规分笼饲养，自然光照，自由饮水、摄食，国家标准啮齿类动物饲料饲养。

1.1.2 实验用药

所用中药苁蓉菟丝子煎剂为熊若虹教授经验方。方中以肉苁蓉、菟丝子为主要成分，配伍紫河车、枸杞、当归等。所有中药材购于四川省医药公司中药材采购站。按处方称取116g生药材，置于陶瓷煎锅内，加水至淹没药面5cm(约1 000ml)，浸泡1小时后武火煮沸，再用文火煎60分钟，滤出药液;再加入开水300mL，继续文火煎30分钟后将药液滤出。将两次滤药合并，静置沉淀，再滤过，加热浓缩滤液至100mL，最终制成浓度为1.16g原生药/mL的水煎剂［12］。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和干预措施

将36只大鼠随机分成三组:安静对照组(Q组)、运动对照组(S组)、中药干预组(M组)，每组12只。S组和M组大鼠进行3天适应性游泳运动后，每日负重(负重量为自身体重的3%)进行一次大强度游泳运动，每周运动6天休息1天，持续5周。每次运动终止标准为:游泳动作出现明显失调，原地打转、不能再坚持或沉入水底超过10秒不能回到水面，捞出水后表现为呼吸急促、静卧不动，翻正反射减弱甚至消失［12-14］。大强度游泳运动期间，M组大鼠每日灌喂一次苁蓉菟丝子煎剂，剂量为25mL/kg体重，Q组和S组大鼠则每日灌喂一次同容积剂量的生理盐水。每日早晨7∶00-8∶00时制备大鼠阴道脱落细胞涂片，用瑞氏染色后在光学显微镜下观察，以监测大鼠动情周期的变化。动物实验在成都体育学院动物实验室进行。

1.2.2 标本制备与指标检测

标本采集于S组和M组大鼠持续5周的大强度游泳运动结束后的24-72小时内、各大鼠处于动情间期时进行。将大鼠用20g/L的戊巴比妥腹腔注射的方法进行麻醉后，在股动脉处取血2mL，并分离出两侧卵巢，将两卵巢分别固定于10%中性甲醛溶液和3%戊二醛溶液中，以备制作卵巢光镜切片和电镜切片。

(1)卵巢光镜切片的制备与观察。

将固定在10%中性甲醛溶液中的卵巢于24h后取出，充分水洗后用70%-100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明、浸腊、包埋，5μm厚连续切片，将切片紧贴于APES处理过的载玻片上，常规苏木精-伊红染色［16］，用普通光学显微镜观察卵巢的组织形态。每个卵巢间断取片3张，在低倍镜下计数生长卵泡(包括初级、次级卵泡)、成熟卵泡、闭锁卵泡以及新鲜黄体数，取平均值。

(2)卵巢电镜切片的制备与观察。

将固定在3%戊二醛溶液中的卵巢于48h后取出，PBS液充分换洗后用1%四氧化锇固定1h，PBS液冲洗，30%-100%丙酮梯度脱水，环氧丙烷浸泡5h，Epon812定向包埋，半薄切片光学定位后用超薄切片机切片，片厚50nm，将其贴附于载网上，用醋酸铀及枸橼酸铅进行双重染色［16］，然后用透射电镜观察卵巢细胞的超微结构。

(3)血液标本的制备与测定。

将动脉血离心后取其血浆，采用放射免疫分析法测定血浆中雌二醇(estradiol，E2)和孕激素(progesterone，P)浓度，所使用的试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，具体操作按照免疫试剂盒说明书进行。

1.2.3 数据处理

使用SPSSfor Windows 17.5软件对实验数据进行统计学处理，所有数值以“平均数±标准差”(±s)表示，应用单因素方差分析进行组间差异比较，P＜0.05为显著性差异。

2 结果

动物实验期间，S组和M组各有2只大鼠死亡，其死亡原因均为游泳过程中呛水而致。最终，Q组12只、S组10只、M组10只纳入结果分析。

2.1 大鼠一般情况

Q组、M组大鼠在整个实验期间总体发育良好，毛发光洁，活泼好动，反应灵敏;S组大鼠在大强度运动训练期间逐渐出现拱背穹起、反应迟钝、精神萎靡、易受惊吓、摄食减少等现象。在大强度游泳运动/中药干预前以及干预期间的第1周末，三组大鼠体重无显著性差异;从第2周末开始至取材前，S组大鼠体重显著性低于Q组(P＜0.05);M组大鼠从第3周末开始至取材前，显著性高于S组(P＜0.05)(见图1)。在训练的开始阶段，两组大鼠运动持续时间无显著性差异，但随着大强度运动的持续进行，S组大鼠运动时间逐渐缩短，而M组大鼠在整个训练期间则无明显变化;从大强度训练的第3周至取材前，M组大鼠运动时间显著性长于S组(P＜0.05)(见图2)。

图1 大鼠体重变化

图2 大鼠运动时间变化

2.2 大鼠动情周期变化情况

在大强度游泳运动持续2-4周左右时，S组大鼠开始陆续出现动情周期紊乱现象，开始以动情周期缩短(≤3天)为主要表现，逐渐转变为动情周期延长(≥6天)为主，部分大鼠甚至表现为持续动情间期。取材前各组大鼠动情周期变化情况见表1。

2.3 卵巢大体形态观察

Q组大鼠卵巢呈卵圆型，淡红色，亮泽，形态饱满，表面可见多个突起的大小不等的结节;与Q组相比，S组大鼠卵巢颜色较为苍白，有萎缩，表面结节较少;而M组卵巢形态与安静对照组相似，饱满亮泽，表面可见多个大小不等的结节突起。

2.4 卵巢组织形态观察

Q组大鼠卵巢皮质较厚，内有丰富的处于不同发展阶段的卵泡以及新鲜黄体，间质内血管丰富。S组大鼠卵巢皮质较薄，典型生长卵泡、成熟卵泡以及新鲜黄体都较Q组少(P＜0.05;P＜0.01)，而闭锁卵泡则明显增多(P＜0.05)较多卵泡明显发育不良，外形扭曲，颗粒层细胞层次较少，排列紊乱，间质内有不同程度的纤维化以及淋巴细胞浸润，血管分布较少。与S组相比，M组大鼠各级生长卵泡和成熟卵泡的数量以及新鲜黄体的数量都表现出不同程度增加(P＜0.05;P＜0.01)，偶可见到发育不良的囊状扩张的卵泡，间质血管丰富，未见明显炎性细胞浸润及纤维化。(见图3、表2)

图3 大鼠卵巢组织形态结构(苏木精-伊红染色，×200)

表2 各组大鼠卵巢卵泡和黄体的比较(±s)

表2 各组大鼠卵巢卵泡和黄体的比较(±s)

注:*与Q组相比，P＜0.05;＊＊与Q组相比，P＜0.01;◆与S组相比，P＜0.05;◆◆与S组相比，P＜0.01。

组别 n 生长卵泡 成熟卵泡 闭锁卵泡 新鲜黄体Q 12 9.89±2.03 3.34±0.96 5.24±1.65 5.05±1.35 S 10 4.57±2.49*＊ 1.68±0.73＊＊ 9.02±2.94* 2.90±1.21*M 10 8.96±2.18◆ 3.67±1.08◆ 6.04±2.55◆◆ 5.26±1.37◆◆

2.5 卵巢颗粒细胞超微结构观察

Q组大鼠卵巢卵泡颗粒细胞的细胞核多为圆形，体积较大，核仁明显，核染色质均匀分布在胞核中;胞浆中可见许多分布均匀的管状嵴线粒体和交织成网的滑面内质网和高尔基体，少量脂滴散在分布在胞浆中;在颗粒细胞之间，还可观察到有桥粒、缝隙连接等细胞连接。S组卵泡颗粒细胞核多不规整，核浆比例较安静对照组小，核膜凹陷有切迹现象，核染色质染色较深，有凝聚现象;胞浆中线粒体、滑面内质网、高尔基体等细胞器明显减少，线粒体呈现出不同程度的肿胀，线粒嵴部分断裂甚至消失;胞浆内有大量脂滴积聚。M组颗粒细胞超微结构接近于Q组，细胞核较大，核染色质均匀分布，胞浆中有丰富的线粒体、滑面内质网、高尔基复合体等细胞器以及散在分布的脂滴。(见图4)

图4 大鼠卵巢细胞超微结构(醋酸铀及枸橼酸铅染色，×6 000)

2.6 血清生殖激素测定

从表3中数据可以看出，与Q组相比，S组大鼠血清E2、P水平均出现明显下降(P＜0.05;P＜0.01);M组E2、P平均水平则比S组高(P＜0.05);而M组与Q组之间两种激素水平无统计学差异(P＞0.05)。

表3 血清生殖激素测定结果(±s)

表3 血清生殖激素测定结果(±s)

注:*与Q组相比，P＜0.05;◆与S组相比，P＜0.05。

组别 n E2(ng/ml) P(pg/ml)Q 12 1.56±0.32 73.81±20.12 S 10 1.17±0.54* 40.70±17.45*M 10 1.69±0.67◆ 78.14±24.80◆

3 讨论

大量研究证实，血清雌激素、孕激素水平降低是长时间、大强度运动训练导致运动性月经失调/动情周期紊乱时最为常见的机体生理生化反应［4，7.13，16，17］，这提示在运动性月经失调/动情周期紊乱的发生与雌激素、孕激素分泌抑制密切相关。雌激素、孕激素属类固醇激素，主要由女性/雌性的性腺卵巢所分泌。卵巢的卵泡和黄体是分泌雌激素和孕激素的结构单位，其中雌激素是主要由生长卵泡、成熟卵泡的颗粒细胞以及排卵后分化而成的黄体颗粒细胞合成与分泌，主要为雌二醇;孕激素则主要是由黄体颗粒细胞所分泌，以孕酮为其主要成分［18］。因此，卵巢内卵泡和黄体数量的多少以及颗粒细胞的内部结构是决定雌激素、孕激素能否正常分泌的物质基础。

本实验中，运动对照组的大鼠在长期大强度游泳过程中，动情周期陆续出现紊乱;与具有正常动情周期的安静对照组大鼠相比，其血浆中的雌激素(雌二醇)、孕激素水平出现显著性下降，这与笔者前期实验结果以及其他学者的同类研究结果一致［4，7，13，16，17］。而在光镜下，笔者观察到运动对照组大鼠卵巢的生长卵泡、成熟卵泡以及新鲜黄体都较安静对照组显著性减少而闭锁卵泡明显增多，并且还可见到较多卵泡明显发育不良，颗粒层细胞层次较少;在电镜下又发现运动对照组卵巢颗粒细胞核多不规整，核浆比例较安静对照组小，核膜凹陷有切迹现象，核染色质染色较深，有凝聚现象;胞浆中参与类固醇激素合成的线粒体、滑面内质网、高尔基体等细胞器明显减少、变性而脂滴大量聚集。这表明了长期大强度运动对卵巢的卵泡发育、卵泡成熟、排卵等过程都具有抑制作用，并使卵巢颗粒细胞内的代谢活动产生不良变化，这将导致卵巢细胞分泌雌激素、孕激素功能抑制，使血浆中雌激素(雌二醇)、孕激素水平出现明显下降，进而导致月经周期或动情周期的紊乱。

祖国传统医学认为，长时间、大强度运动量训练导致机体过度劳累引起肝肾不足，气血两虚是导致运动性月经失调的主要病机。肾主骨，肝主筋。女运动员在长时间大强度运动训练中，因“久立伤骨，久行伤筋(《素问·宣明五气篇》)”，骨伤则肾伤，筋伤则肝伤，肝肾不足，气血两虚，直至冲任受损而发生月经失调［9，19，20］。本次实验中所用中药苁蓉菟丝子煎剂主要由肉苁蓉、菟丝子配伍枸杞、紫河车、当归等药材而组成。其中肉苁蓉入肾经，补命门，滋润五脏，益髓强筋，可治疗五劳七伤，具有补肝肾、填精益髓、温肾暖宫、调理脏腑阴阳等的功能;菟丝子归肝肾脾经，可补肝肾益精养血，为补肝肾经要药;紫河车为血肉有情之品，入肺肝肾经，能补精血益冲任;枸杞能滋肝肾之阴，为平补肾精肝血之品;当归补血活血，为补血调经之圣药。［21］苁蓉菟丝子煎剂全方主要通过补肝肾、益气血、调补冲任来对运动性月经失调进行防治。

与运动对照组相比，中药干预组大鼠虽然同样承受着长期力竭运动的影响，但其卵巢中各级生长卵泡和成熟卵泡的数量以及新鲜黄体的数量都表现为明显的增加而闭锁卵泡明显降低。这说明本实验中所用方剂苁蓉菟丝子煎剂可预防长期力竭运动对卵泡生长发育以及排卵的抑制作用，有效促进卵巢卵泡的发育与成熟以及排卵功能。中药干预组颗粒细胞超微结构也较运动对照组有明显改变，细胞核较大，核染色质均匀分布，胞浆中线粒体、滑面内质网、高尔基复合体等细胞器较为丰富，脂滴散在分布，这可表明苁蓉菟丝子煎剂可改善卵巢细胞内代谢水平，使其功能活性增强，有利于胆固醇转化为雌激素、孕激素，促进卵巢实质细胞的内分泌功能，防止长期力竭运动低性腺激素水平的状态，调节女子月经周期/动情周期。

4 结论

长期大强度运动对卵巢的卵泡发育、成熟、排卵以及黄体的形成等过程具有抑制作用，并使卵巢颗粒细胞内超微结构产生不良变化，这会导致卵巢分泌雌激素、孕激素等性激素的功能发生障碍进而影响月经周期或动情周期。苁蓉菟丝子煎剂则可有效预防和改善长期大强度运动对卵巢卵泡发育和排卵以及黄体生成的抑制作用，改善卵巢课题细胞的超微结构，促进卵巢颗粒细胞内代谢水平，改善其分泌功能，使性激素合成功能增强，这有助于预防运动性月经失调的发生。

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