胆管上皮细胞TLR3内源性活化在原发性胆汁性肝硬化炎性损伤中的作用

蒋廷旺，熊怀民，张红星，许国华，许晔琼

（常熟市医学检验所，江苏常熟215500）

胆管上皮细胞TLR3内源性活化在原发性胆汁性肝硬化炎性损伤中的作用

蒋廷旺，熊怀民，张红星，许国华，许晔琼

（常熟市医学检验所，江苏常熟215500）

目的：研究内源性双链RNA活化人肝内胆管上皮细胞（human intrahepatic bi1iary epithe1ia1 ce11s，HiBEC）中To11样受体3（To11-1ike receptor 3，TLR3）引起的凋亡及其信号通路变化。方法：体外培养HiBEC，同时通过反复冻融制备坏死的HiBEC。TLR3活化组：将死亡细胞与活细胞共同培养6 h；对照组：以核酸酶处理过的坏死细胞与活细胞共培养，每组设3复孔。以Annexin V/PI测定细胞凋亡率，同时以JC-1荧光探针测定细胞线粒体膜电位。荧光定量PCR法检测TLR3和β干扰素To11样受体结构域衔接蛋白（To11-inter1eukin 1 receptor domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）的表达量，同时以流式细胞术测定Caspase-3的活性。结果：TLR3活化组的HiBEC经内源性活化后，凋亡率为（33.32±2.39）％，明显高于通过RNA酶处理后的对照组［（2.83±0.53）％，P＜0.001）；线粒体膜电位检测结果表明，TLR3活化组的HiBEC经内源性活化后，表达绿色荧光的细胞比例明显增加，均值为（34.75± 6.54）％，明显高于RNA酶处理后的对照组［（3.21±1.24）％，P＜0.001）；定量PCR分析发现TLR3活化组的TLR3和TRIF mRNA相对表达量分别为3.75±0.22和4.05±0.14，均明显高于对照组（分别为0.98±0.05和1.03±0.07，P＜0.001）；流式细胞术检测结果显示，TLR3活化组细胞Caspase-3的平均表达量为（27.1±3.5）％，明显高于RNA酶处理组［（8.5±2.1）％，P＜0.001）。结论：内源性双链RNA可以通过活化TLR3诱导HiBEC凋亡，可能在原发性胆汁性肝硬化的炎性损伤过程中发挥重要作用。

原发性胆汁性肝硬化；胆管上皮细胞；To11样受体3；内源性

原发性胆汁性肝硬化（primary bi1iary cirrhosis，PBC）的早期病理改变为肝内胆管上皮细胞（human intrahepatic bi1iary epithe1ia1 ce11s，HiBEC）周围的炎性细胞浸润，随着疾病的进展，肝内小胆管进行性消失，最终引起肝硬化和肝衰竭［1］。一直以来众多学者始终将HiBEC在PBC中作为一个被动的“受害者”看待，仅注意到自身反应性T细胞、NK细胞等直接效应作用导致HiBEC的凋亡［2］，忽视了其主动参与免疫调节的能力。胆管上皮细胞可以表达多种To11样受体（To11 1ike receptor，TLR）及黏附分子，并通过分泌细胞因子、趋化因子等参与炎症反应的免疫调节［3］。但是HiBEC在PBC中具有怎样的调节作用尚缺乏相关研究。

TLR是一类介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，在细胞活化信号的转导中发挥重要作用，是联系天然免疫与适应性免疫的桥梁［4］。近年来，研究表明TLR介导的天然免疫在PBC的HiBEC炎性损伤过程中同样具有重要意义［5-6］。TLR3是TLR家族中的重要成员，不仅在宿主抗病毒过程中具有重要作用，而且还与一些自身免疫病的发生存在密切关系。双链RNA（doub1e-stranded RNA，dsRNA）是TLR3所识别的病原相关分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar patterns，PAMP），多种病毒在复制期间可以产生大量的dsRNA，因此，TLR3可以作为机体抗病毒的重要防线。然而，近期的研究发现坏死细胞释放的RNA或体外转录产生的mRNA同样可以活化TLR3，提示体内坏死组织释放的RNA可以作为TLR3的内源性配体启动或调节免疫应答［7-8］。由于大部分自身免疫病并未发现与病毒感染具有直接联系，因此，内源性配体对TLR3的活化在自身免疫病的发病机制中可能具有更为重要的意义。

为此，我们通过反复冻融HiBEC模拟PBC中坏死的胆管上皮细胞，并以其释放的内源性dsRNA活化其他HiBEC的TLR3，观察HiBEC在此过程中的凋亡及其信号通路变化。

1 材料与方法

1.1 材料

HiBEC（Science11公司，美国），胎牛血清、RPMI 1640培养基（Hyc1one公司，美国），谷氨酰胺、Benzonase核酸酶（Sigma公司，美国），线粒体膜电位检测试剂盒、细胞固定/破膜液、Caspase-3抗体（BD bioscience公司，美国），RNA提取试剂盒（Qiagen公司，美国），Annexin V/PI（Bender MedSystems，澳大利亚）。FACSCa1ibur流式细胞仪（BD公司，美国），PCR分析仪（ABI公司，美国），超净工作台（苏州净化设备厂）；细胞培养箱（BeckMan公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 HiBEC的培养及内源性活化 将HiBEC在37℃，5％CO2条件下培养于RPMI 1640完全培养基中（10％胎牛血清，50 μg/mL青霉素，2 mmo1/L谷氨酰胺，10 mmo1/L HEPES）。坏死细胞的制备参考文献［7］中的方法，即将一定数目的HiBEC反复冻融4次后制备死亡细胞。将死亡细胞与培养的HiBEC按照2∶1的比例，在4℃条件下共同孵育6 h，作为TLR3活化组；以Benzonase核酸酶处理的死亡细胞和HiBEC共培养作为对照组，每组设3个复孔。再次37℃，5％CO2培养36 h。

1.2.2 流式细胞术检测HiBEC的凋亡率 收集细胞，预冷PBS洗涤后以结合缓冲液［50 mmo1/L三羟甲基氨基甲烷（Tris），100 mmo1/L NaC1，1％BSA，0.02％叠氮化钠，pH 7.4）重悬细胞并调节细胞密度至5×105/mL；195 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin-V，室温放置10 min；洗涤后再以190 μL结合缓冲液重悬，加入10 μL 20 μg/mL PI；流式细胞仪测定细胞凋亡率，Annexin V-/PI+、Annexin V+/ PI-、Annexin V+/PI+分别表示死细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。

1.2.3 线粒体膜电位分析 收集培养的细胞以预冷的PBS洗涤后，重悬至1×106/mL；每个15 mL离心管中加入1 mL细胞悬液，室温400×g离心5 min，弃上清；每管加入0.5 mL新鲜配制的JC-1工作液，充分混匀后置于37℃的CO2培养箱孵育15 min；按照以下步骤洗涤细胞2次：第1次，每管加2 mL 1×分析液，轻轻振荡悬浮细胞并使其分散，以免聚集成块。400×g，室温离心5 min，弃上清；第2次，每管加1 mL1×分析液，振荡或用枪头使细胞悬浮分散，以免聚集成块。400×g，室温离心5 min，弃上清；每管加0.5 mL 1×分析液，轻轻悬浮细胞，以流式细胞仪进行检测分析。绿色荧光说明线粒体膜电位下降，细胞很可能处于凋亡早期；红色荧光说明线粒体膜电位正常，细胞未发生凋亡，用红绿荧光的相对比例来表示细胞膜电位变化。

1.2.4 定量PCR检测HiBEC中TLR3、β干扰素To11样受体结构域衔接蛋白（To11-inter1eukin 1 receptor domain-containing adaptor inducing interferonβ，TRIF）mRNA的表达 收集各组细胞，抽提细胞总RNA，根据基因库中人TLR3、TRIF和β-肌动蛋白的mRNA序列合成引物，以SYBR-Green法定量分析上述基因表达。TLR3上游引物：5′-TGAGTTAGATATGCGCTTTA-3′，下游引物：5′-TCAGGGATGTTGGTATGG-3′；TRIF上游引物：5′-CAAGCCGTGCCCACCTACT-3′，下游引物：5′-TGTTCCGATGATGATTCCAG-3′；β-肌动蛋白上游引物：5′-GAAATCTGTCAAAGTTCA-3′，下游引物：5′-AGGCAGCTCGTAGCTCTT-3′。将总RNA反转录为cDNA，反应条件：25℃10 min、48℃30 min、95℃5 min。在ABI Prism7000定量PCR仪上进行扩增，读取阈循环值（thresho1d cyc1e，Ct），根据公式：ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct和ΔΔCt=研究组ΔCt-对照组ΔCt，计算出2-ΔΔCt。

1.2.5 流式细胞术检测Caspase-3活性 按照每个测试样本加入100 μL Perm/Wash缓冲液和20 μL抗体，计算抗体和Perm/Wash缓冲液用量。根据用量制备Perm/Wash缓冲液（1×），将10×浓度缓冲液使用蒸馏水进行10倍稀释；用冷PBS缓冲液洗细胞2次，再用细胞固定/破膜液调整细胞密度为1×106/0.5 mL；细胞冰浴20 min；离心，弃上清；室温下，使用1×Perm/Wash缓冲液洗细胞2次，Perm/Wash缓冲液的用量为每1×106细胞0.5 mL；按样本数加入1×Perm/Wash缓冲液和抗体，混匀，室温反应30 min；每管用1.0 mL1×Perm/Wash缓冲液洗细胞1次，再用0.5 mL的1×Perm/Wash缓冲液制成细胞悬液，应用流式细胞仪检测Caspase-3活性。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有资料均为计量资料，采用两样本等方差t检验进行比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内源性RNA诱导HiBEC凋亡

HiBEC与反复冻融后的细胞裂解液共培养后的凋亡率为（33.32±2.39）％，而通过RNA酶处理后的对照组凋亡率为（2.83±0.53）％，两组间差异有统计学意义（t=21.62，P＜0.001）。见图1。

A：TLR3活化组；B：RNA酶处理组图1 内源性RNA诱导HiBEC凋亡

2.2 线粒体膜电位

流式细胞术检测结果显示，TLR3活化组HiBEC线粒体膜电位发生明显改变，表达绿色荧光的细胞比例明显增加，平均为（34.75±6.54）％，明显高于RNA酶处理后的对照组［（3.21±1.24）％］，两组间差异有统计学意义（t=17.21，P＜0.001）。

2.3 两组细胞TLR3和TRIF mRNA的表达水平

定量PCR分析结果显示，TLR3活化组细胞的TLR3 mRNA和TRIF mRNA相对表达量分别为3.75± 0.22和4.05±0.14，明显高于RNA酶处理后的对照组［TLR3 mRNA为0.98±0.05，t=17.56，P＜0.001；TRIF mRNA为1.03±0.07，t=28.86，P＜0.001）］。

2.4 各组细胞Caspase-3的活性

流式细胞术检测结果显示，TLR3活化组细胞Caspase-3阳性率为（27.1±3.5）％，明显高于对照组［（8.5±2.1）％，t=6.56，P＜0.001）］。见图3。

图3 HiBEC体外作用后Caspase-3的活化

3 讨论

TLR3在PBC及其他胆汁淤积相关疾病中的作用近年来备受关注。Shimoda等［9］通过分离PBC患者肝组织单个核细胞、单核细胞、NK细胞及胆管上皮细胞进行体外实验，发现TLR3与TLR4共同作用下，NK细胞对HiBEC的杀伤作用明显增强。但是该研究并未说明HiBEC是否主动参与及如何参与PBC的炎性损伤过程。Harada等［10］通过分离胆汁淤积患者HiBEC进行po1yIⅠ：C体外诱导实验，证实po1y：C可以明显上调胆管上皮细胞表面肿瘤坏死因子凋亡相关配体（TRAIL）的表达，并促进Hi-BEC的凋亡。我们前期将po1yI：C注射到C57BL/6小鼠腹腔，在国内率先建立了PBC小鼠模型；发现16周后小鼠肝内汇管区出现明显的炎性细胞浸润，同时血清出现抗线粒体抗体、抗核抗体等自身抗体［11］。我们的研究结果提示，po1yI：C活化的TLR3信号途径可能在PBC的病理改变及疾病进程中具有重要作用。然而，po1yI：C是一种模拟dsRNA的外源性TLR3活化物质，PBC患者体内是否能够产生内源性dsRNA同样活化TLR3参与炎症反应？

为此，我们在体外通过反复冻融制备坏死的HiBEC，然后与正常HiBEC共培养，发现HiBEC出现明显的凋亡。由于线粒体膜电位降低是细胞发生凋亡的标志性事件，因此为了进一步验证其凋亡作用，本研究进一步分析了细胞膜电位，发现TLR3活化组细胞的膜电位明显降低，且改变比例与凋亡结果相符合。HiBEC是PBC病理改变最早侵犯的组织细胞，这一结果说明在PBC患者肝组织出现病变后，HiBEC发生坏死或凋亡所释放的内源性RNA可以通过TLR3途径进一步活化周边正常上皮细胞，促进炎症反应，进而导致PBC病情恶化。国外多项研究表明，坏死细胞提取物可通过TLRs活化树突状细胞，促进其表型改变及细胞因子的分泌［7］。然而对于HiBEC是否存在类似的生物学效应目前尚不明确，我们的研究证实了该作用的存在。

大量的研究表明，TLR3除通过诱导产生多种细胞因子参与免疫调节之外，还可以直接诱导细胞凋亡。TLR3有两条信号通路，一条是髓样细胞分化因子88（MyD88），另一条是TLR3独有的MyD88非依赖信号通路。通过MyD88信号通路可以激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NK-κB，最终引起TNF-α、IL-6等细胞因子的表达，参与炎症反应。MyD88非依赖性信号通路是通过TIR区域的调节分子1（也称为TRIF）传递信号，通过活化IFN调节因子3（IRF3）诱导产生IFN-β［12］。本研究结果显示，TLR3活化组HiBEC的TLR3和TRIF mRNA表达量均明显增加，更加明确了HiBEC的凋亡和线粒体膜电位的改变是由TLR3通路引起的，并且该通路是通过MyD88非依赖途径，经由TRIF信号分子进行下游活化，进而导致细胞凋亡和膜电位变化。

Caspase-3是早期凋亡信号通路中的关键分子，产生时以非活化的前体形式存在，当凋亡发生时，经其他蛋白酶水解后转化为有活性的Caspase-3。我们以流式细胞术分析其生物活性，发现经死亡Hi-BEC作用后，表达Caspase-3的细胞明显增加，而对照组则没有明显改变。这证明TLR3内源性活化引起的凋亡是通过Caspase-3途径完成的，进一步明确了凋亡发生的信号途径。

综上，本研究证实了PBC患者的胆管上皮细胞受损后释放的内源性RNA可通过活化其他正常细胞TLR3促进炎症反应，该作用主要表现为诱导凋亡，而且凋亡的发生是通过MyD88非依赖途径完成。这对进一步明确PBC发病机制及其今后的生物治疗具有提示意义。

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Roles of endogenous activation of TLR3 in primary biliary cirrhosis

JIANG Ting-wang，XI0NG Huai-min，ZHANG Hong-xing，XU Guo-hua，XU Ye-qiong
（Changshu Municipa1 Institution for Laboratory Medicine，Changshu Jiangsu 215500，China）

Objective：To investigate apoptosis induced by endogenous doub1e-stranded RNA（dsRNA）activating TLR3 and the fo11owing signa1 pathway in human intrahepatic bi1iary epithe1ia1 ce11s（HiBEC）. Methods：HiBEC were cu1tured in vitro，and necrotic ce11s were prepared by freeze-thawing the ce11s four times.HiBEC were co-cu1tured with necrotic ce11s in TLR3-activation group for 6 h.Necrotic ce11s incubated with Benzonase were used as contro1s.Ce11s apoptosis was determined by using annexin V/PI.Changes of mitochondria1 membrane potentia1 were assayed by JC-1.TLR3 and To11-inter1eukin 1 receptor domaincontaining adaptor inducing interferon-β（TRIF）were ana1yzed by qPCR.Activity of Caspase-3 in HiBEC was ana1yzed by f1ow cytometry.Results：Percentages of apoptotic HiBEC in TLR3-activation and contro1 group were（33.32±2.39）％and（2.83±0.53）％，respective1y（P＜0.001）.Ratio of HiBEC with green f1uorescence in TLR3-activation group was（34.75±6.54）％，obvious1y higher than that in contro1 group［（3.21±1.24）％，P＜0.001）］.Re1ative expression of TLR3 and TRIF mRNA were 3.75±0.22 and 4.05±0.14 in TLR3-activation group，0.98±0.05 and 1.03±0.07 in contro1 group（P＜0.001）. The average Caspase-3 expression in TLR3-activation group was（27.1±3.5）％，more than that in contro1 group（8.5±2.1）％（P＜0.001）.Conclusion：Endogenous RNA cou1d induce HiBEC apoptosis by acti-vating TLR3 pathway，which may p1ay important ro1es in porta1 inf1ammation in primary bi1iary cirrhosis.

primary bi1iary cirrhosis；bi1iary epithe1ia1 ce11s；To11-1ike receptor 3；endogenous

R575.2

A

1671-7783（2015）06-0472-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150182

2015-08-24 ［编辑］ 陈海林

国家863计划资助项目（2014AA022304）；常熟市科技发展计划社会发展项目（CS201313）

蒋廷旺（1981—），男，江苏新沂人，助理研究员，博士，主要从事自身免疫性肝病、病毒性肝炎的发病机制及实验室诊断研究。