软肝冲剂对四氯化碳所致小鼠肝纤维化模型的影响

王学良，卢秉久

（辽宁中医药大学附属医院，沈阳110032）

软肝冲剂对四氯化碳所致小鼠肝纤维化模型的影响

王学良，卢秉久*

（辽宁中医药大学附属医院，沈阳110032）

目的 观察软肝冲剂对四氯化碳性肝纤维化小鼠模型的治疗作用。方法 取50只雄性SPF级C57B／L小鼠，随机分为空白对照组、模型组和软肝冲剂治疗组。给予空白对照组100%花生油1 mL／kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型组给予含20%四氯化碳的花生油1 mL／kg腹腔注射，2次／周，共10周；软肝冲剂3个治疗组第3周起给予软肝冲剂高、中、低7.5、5.0、3.5 g／（kg・d）剂量灌胃至第10周。在实验结束后，检测小鼠血清中的透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、三型前胶原（PCⅢ）、四型胶原（Ⅳ-C）、丙氨酸转氨酶（ALT）和天门冬氨酸转氨酶（AST）的含量；计算肝脏指数；使用Masson和HE染色观察肝脏的病理组织学改变。结果 软肝冲剂组血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的含量均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组和高剂量组肝脏指数与模型组相比具有统计学意义（P＜0.05）；病理学检查发现软肝冲剂中、高剂量组小鼠肝脏的炎性浸润和脂肪空泡消失，Masson染色显示在汇管区无纤维素沉积。结论 软肝冲剂可以降低四氯化碳所致小鼠肝纤维化模型中血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的水平，对肝脏具有保护作用。

软肝冲剂；四氯化碳；肝纤维化

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病发展到一定阶段的共同特征，从病理学角度上看，肝纤维化是肝细胞基质代谢异常，表现为细胞外基质的合成增多而分解减少，最终导致其大量沉积的过程［1-5］。近年来，随着肝纤维化无创诊断的普及推广，其检出率明显升高，因此抗肝纤维化治疗成为新一轮的研究热点［6］。目前西医治疗肝纤维化尚无特效方法，在代偿期主要以护理为主；失代偿期主要采用支持疗法以控制疾病发展速度。抗肝纤维化的西药如秋水仙碱、青霉胺等，在动物实验中可从一定程度上改善肝纤维化的症状，但在临床应用中疗效并不十分理想，而且毒副作用大。而传统中医药，尤其是中药复方具有多成分、作用于多个靶点，可以通过多途径、多环节、多层次发挥治疗作用的特点，因此寻找和进一步发掘中药抗肝纤维化的药物及其效应机制被认为是抗肝纤维化的有效途径［7-8］。如姜辉等［9］就通过实验研究证明三七总皂苷对肝纤维化大鼠肝脏具有明显保护作用。本文旨在通过探讨中药复方软肝冲剂对四氯化碳性所致肝纤维小鼠模型的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要仪器 实验动物C57B／L小鼠50只，体质量（20±1）g，4～5周龄，由辽宁长生生物技术有限公司提供，全自动生化检测仪，721可见光分光光度计。

1.2 药物 水合氯醛及四氯化碳（CCl4分析纯）均从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购入；鲁花牌花生油购于超市；HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C试剂盒购自上海研晶生物科技有限公司；ALT和AST坚持试剂购于上海科华检验医学产品有限公司；软肝冲剂由辽宁中医药大学附属医院制剂中心煎制。

1.3 实验分组和动物模型制备 取SPF级C57B／L雄性小鼠随机为空白对照组、模型组和软肝冲剂治疗组，其中正常组、模型组每组各10只，软肝冲剂治疗组30只，并按照给药剂量不同分为软肝冲剂低剂量组、中剂量组和高剂量组 ，按《药理实验方法学》［10］中方法换算成大鼠给药量剂量分别为 3.5、5.0、7.5 g／（kg・d），每组10只。空白对照组100%花生油按照1 mL／kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型组给予含20%四氯化碳的花生油1 mL／kg腹腔注射，每周2次，共10周；软肝冲剂组给予含20%四氯化碳的花生油1 mL／kg腹腔注射，每周2次，共10周，并从第3周起至第10周，给予软肝冲剂（剂量按人体-大鼠体表面积比值换算）灌胃高、中、低剂量组分别为7.5、5.0、3.5 g／（kg・d），空白对照组和模型组在同期内给予生理盐水灌胃。

1.4 组织采样 在小鼠处死前，通过摘取眼球取血，经离心后将血清用全自动生化分析仪分析HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST各项指标；摘取肝脏称重，计算肝脏指数，并留取部分肝脏组织浸泡在5%的福尔马林溶液中固定，做Masson和HE染色。

1.5 统计学方法 实验数据用SPSS 11.5软件处理，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用 t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软肝冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠肝脏指数的影响 见表1。

表1 软肝冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠肝脏指数的影响（±s，n＝10）

表1 软肝冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠肝脏指数的影响（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较 ，＃P＜0．05；与模型组比较 ，△P＜0．05

／%空白对照组 — 3．0±0．8模型组 — 4．8±1.1＃软肝冲剂低剂量组 3．5 4．7±0．9＃软肝冲剂中剂量组 5．0 3．8±0．5△软肝冲剂高剂量组 7．5 3．5±0．4组 别 给药剂量／（g／kg） 肝脏指数△

2.2 软肝冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠肝功能指标的影响 见表2，表3。通过HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C试剂盒检测其在血清中的含量；通过全自动血液生化分析仪检测ALT和AST在血清中的含量。

表2 软干冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠血清中ALT和AST的影响（±s，n＝10） U／L

表2 软干冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠血清中ALT和AST的影响（±s，n＝10） U／L

注：与空白对照组比较 ，＃P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

AST空白对照组 33．7±4．5 41．7±6．5模型组 140．4±9．8＃ 198.2±9．7＃软肝冲剂低剂量组 115．4±7．6＃ 182．5±6.3＃软肝冲剂中剂量组 104．4±8.2＃△ 155．6±11.2＃软肝冲剂高剂量组 102.1±6．5＃△ 133.1±10.1组 别 ALT＃△

表3 软肝冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响（±s，n＝10） μg／L

表3 软肝冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响（±s，n＝10） μg／L

注：与空白对照组比较 ，＃P＜0.05；与模型组相比较 ，△P＜0.05

组 别 HA LN PCⅢ Ⅳ-C空白对照组 110．22±21．31 119．26±23．21 140．23±40．66 94．23±18．34模型组 500．11±82．12＃ 421．65±50．43＃ 487．34±40．21＃ 300．11±40．21＃软肝冲剂低剂量组 321．45±44．21＃△ 300．02±43．89＃△ 340．64±30．20＃ 199．22±31．12＃软肝冲剂中剂量组 220．54±20．65△ 263．11±54．24△ 243．41±47．32△ 140．33±32．21△软肝冲剂高剂量组 132．71±32．11△ 141．65±30．67△ 160．32±31．26△ 104．23±21．01△

2.3 软肝冲剂对四氯化碳性肝纤维小鼠肝脏病理变化的影响 空白对照组中的小鼠肝细胞边界清晰，胞膜完整，细胞核核膜完整，胞浆染色均匀，肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，无炎细胞浸润，Masson染色显示在中央静脉和门管区无纤维增生；模型组中的小鼠肝细胞不完整、形态大小不均一，肝细胞脂肪变性清晰可见，有假小叶的形成，同时伴有炎性浸润，Masson染色显示在中央静脉和门管区有纤维增生；软肝冲剂低剂量组中，病理改变与模型组相似；软肝冲剂高剂量组中，肝细胞结构完整，未见脂肪变与假小叶形成，Masson染色无纤维沉积。

3 讨论

软肝冲剂是在中医“标本兼治”基本思想的指导下，继承已故全国名老中医、肝病专家王文彦教授肝硬化、肝纤维化发病的中心环节为“脾虚肝郁”，其他血瘀、水停皆由此产生的学术思想，由经验方软肝煎运用现代制剂技术制成。方中柴胡配白术以疏肝解郁、健脾益气，2药共为君药，乃方之根基；以延胡索、木香、荔枝核行气活血止痛，郁金、丹参活血化瘀，4药共为臣，以治气滞血瘀之标，柴胡、郁金、丹参3药被卢秉久教授誉为“肝病三剑客”［11］；佐以莪术、鳖甲、水红花子、蓼实以活血消癥化积、软坚散结；泽兰善于利水，兼有活血之功，可防瘀血、水浊互结腹中而成鼓胀。本实验采用经典四氯化碳作为诱导动物机体产生肝纤维化和肝硬化的肝毒物［12］。其检测指标LN是细胞外间质中非胶糖蛋白的成分，当肝脏发生慢性炎症损伤时肝细胞、内皮细胞以及上皮细胞均参与合成LN，并在肝窦内大量累积［13］；HA是一种糖胺多糖，由间质细胞合成、分泌，肝脏受损时由于合成增多，肝脏代谢能力下降，血清HA水平增高，其也是反映肝纤维化最具价值的血清学标志物［14］，故血清中HA、LN水平可真实反映肝脏炎症程度，并与肝纤维化程度密切相关［15］。本实验证实软肝冲剂可以明显改善四氯化碳性肝纤维化模型小鼠血清中肝纤维化、肝功能指标，并使小鼠肝脏的炎性浸润和脂肪空泡消失、汇管区无纤维素沉积，具有明显的保肝作用。

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Ruan Gan Granule in mice caused by carbon tetrachloride liver fibrosis model

WANG Xueliang，LU Bingjiu*
（Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM，Shenyang 110032，China）

Objective To observe the therapeutic effect of Ruangan Granule on CCl4induced liver fibrosis model in mice．Methods The 50 male SPF C57B／L mice，which were rando mLy divided into control group，model group and treatment group，Ruangan granule．Give control group 100%1 mL／kg intraperitoneal injection of peanutoil，2 times a week，a total of 10 weeks；model group were fed with 20% carbon tetrachloride peanut oil by intraperitoneal injection of 1 mL／kg，2 times a week，a total of 10 weeks of treatment；Ruangan Granule group third weeks for Ruangan Granule（dose in rats according to the human body surface area ratio conversion：high dose group 7．5 g／（kg・d）middle dose group；5 g／（kg・d）；low dose group 3．5 g／（kg・d）by gavage to tenth weeks．At the end of the experiment，detection of hyaluronic acid in serum（HA），laminin（LN），procollagen type three（PCⅢ），type four collagen（Ⅳ-C），alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）levels to calculate the liver index；staining；the liver histopathological changes using Masson and HE．Results The content of Ruangan Granule group in serum HA，LN，PCⅢ，IV-C，ALT and AST were lower than the model group，the difference was statistically significant（P＜0．05）；middle dose group and high dose group liver index compared with the model group has statistical significance（P＜0．05）；pathological examination revealed that inflammatory soft liver granule medium dose and high dose group mice liver and fat vacuoles disappeared，Masson staining showed no fibrindeposition in the portal area．Conclusion Ruangan Granule can reduce the hepatic fibrosis model induced by CCl4in mice serum HA，LN，PCⅢ，Ⅳ-C，ALT and AST level，has a protective effect on liver．

Ruangan Granule；liver fibrosis；carbon tetrachloride

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0911-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．010

2015-03-17）

辽宁省自然科学基金计划项目（201102142）；社会发展公关计划项目（2012225018）。

王学良（1981-），男 ，硕士研究生 ，主治医师，主要从事中医肝病方向研究。

*通信作者：卢秉久，电话-18102457027，电子信箱-lubingjiu＠163．com