贵州黑山羊GnRHR基因与繁殖性状相关性的研究

张劲松 龙威海 许厚强 冯文武 陈祥*

（1，贵州省习水县农牧局 564600；2，贵州大学动物科学学院贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室 550025）

贵州黑山羊GnRHR基因与繁殖性状相关性的研究

张劲松1龙威海2许厚强2冯文武2陈祥2*

（1，贵州省习水县农牧局 564600；2，贵州大学动物科学学院贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室 550025）

研究GnRHR基因SNP与贵州黑山羊繁殖性状关联性。试验采用PCR-SSCP技术检测GnRHR基因单核苷酸多态性。结果发现，贵州黑山羊GnRHR基因外显子1检测到1个SNP位点G121A。基因型与繁殖性状关联分析显示，贵州黑山羊GnRHR基因AA基因型个体产羔数显著高于与AG和GG基因型个体（P＜0.05）。结果提示：GnRHR基因可能是影响山羊产羔数的主效基因。

GnRHR；基因；遗传；繁殖性状；贵州黑山羊

促性腺激素释放激素受体（Gonadotropin releasing hormone receptor，GnRHR）是垂体促性腺细胞合成的一种高亲和G蛋白偶联受体，在垂体促性腺细胞表面与促性腺激素释放激素的结合，从而促进促卵泡素和促黄体素的合成和释放，对动物机体的繁殖进行调控。近年来，把GnRHR基因作为影响动物繁殖性能的候选基因来研究，取得了一系列研究成果。黄杨河[1]等采用PCR-SSCP技术对GnRHR基因在川东白山羊、贵州白山羊和古蔺马羊进行了研究，发现一处碱基突变，且多态性与产羔数显著相关。国内外对动物和人的GnRHR基因已有报道，但对于贵州黑山羊GnRHR基因多态性的研究尚未见报道。本试验采用PCR-SSCP及PCR产物直接测序技术对GnRHR基因在贵州黑山羊的多态性位点进行检测，以探寻GnRHR基因多态性与产羔数之间的相关性，为进一步研究贵州黑山羊繁殖性状的遗传机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验均采集具有前3胎产羔记录的贵州黑山羊102只采自贵州省黔西县。

1.2 主要实验试剂

Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒，聚丙烯酰胺凝胶， 琼脂糖凝胶， 2xEs Taq Master Mix， DM2000，Buffer1xTBE缓冲液均购自贵州鼎国生物工程有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据NCBI中GenBank数据库中绵羊GnRHR(登录号：BC120472)基因序列进行引物设计。利用Primier-BLAST在线软件设计特异性引物，引物信息见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 SSCP分型及测序

PCR反应程序为95℃ 3min；34个循环（95℃ 30s，表1温度30s，72℃ 30min）；72℃延伸5min；4℃保存。PCR反应体系为 20μL： 2×Taq PCR Master Mix 10μL， DNA 模板 2μL，上、下游引物各1.5μL，加水至20μL。SSCP所需PCR产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。取5μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。取7μL的PCR产物和7μL的变性剂，100℃水浴10分钟后置于-20℃冰箱中20min。点样完成后先进行250V电压预电泳30min，后110V电压进行16h左右电泳，最后经固定、银染、显色后进行分辨条带带型。选择条带单一的PCR产物送交北京诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序。用DNAStar软件对序列结果进行校正，BLAST分析确定SNPs。

表1 引物相关信息

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP分型及测序

在贵州黑山羊GnRHR-T引物所扩增的PCR产物分别进行SSCP分析，结果显示扩增序列在贵州黑山羊样品中均出现3种带型，纯合型定义为AA型和GG型，杂合型定义为AG 型 (图 1)。

图1 PCR-SSCP电泳图谱

选择贵州黑山羊不同基因型个体PCR产物送交公司测序，通过SepMan程序分析测序结果并比对，在GnRHR基因第1外显子121bp发生突变，突变前后均未引起氨基酸的改变。

图2 多态位点测序峰图

2.2 GnRHR基因SNP位点群体遗传变异分析

对G121A进行遗传参数统计，结果见表2。由表可知：贵州黑山羊以AG基因型为优势基因型，基因型频率为0.480。优势等位基因为G，其频率为0.603。贵州黑山羊群体表现为中度多态（0.25＜PIC＜0.5）。

表2 G121A位点遗传参数

2.3 GnRHR基因多态性与繁殖性状关联性分析

由表3可知，在贵州黑山羊试验群体中，AA基因型与AG和GG基因型差异显著（P＜0.05），而AG基因型与GG基因型差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

GnRHR数量的增加能引起LH的高峰，而动物的排卵主要依靠LH高峰。因此，GnRHR基因对动物的繁殖性能起着重要的作用。垂体GnRHR浓度的升高能促进哺乳动物的排卵，而GnRHR的缺失则引起排卵障碍，进而导致不育。近几年来，对GnRHR基因与繁殖性能的关系展开大量研究。Dun[2]等对母鸡群体GnRHR基因检测，结果发现GnRHR基因对母鸡产产蛋数和双黄蛋分别具有显性效应和加性效应；柳楠[3]等检测了GnRHR基因在崂山奶山羊的单核苷酸多态性，结果显示该基因A261G突变，对于经产母羊GA型产羔数显著高于AA型；张育军[4]等检测了GnRHR基因外显1和外显子2的多态性，发现外显子2内的突变对于黄淮山羊产羔数BB型比AA型多0.66只，差异显著；朱广琴[5]等研究发现GnRHR基因外显子1存在G→A的突变，在黄淮山羊AA型产羔数高于AG型产羔数；黄杨河[1]等对波尔山羊及其他9个地方山羊品种GnRHR基因多态性进行检测，发现一个突变位点与本研究的G121A突变位点相同，并且在贵州黑山羊两个群体中AA基因型个体的产羔数都显著高于GG和GA基因型。综上所述，GnRHR基因对影响贵州黑山羊产羔数有一定的影响，可能是影响其产羔性状的候选基因。

表3 G121A位点不同基因型与不同山羊品种与产羔数的相关分析

[1] 黄杨河,王凭青,杨力,储明星,张宝云,邓腊梅,谭颖,樊奇.促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因多态性及其与山羊产羔数的相关性分析[J].畜牧兽医学报,2012(1):22-28.

[2]Dunn I C,Miao Y W,Morris A,et al.A study of association between genetic markers in candidate genes and reproductive traits in one generation of a commercial broiler breeder hen population[J].Heredity,2004,92(2):128-134.

[3]柳楠,马晓丽,程明,等.GnRHR基因多态性与崂山奶山羊产羔数的关联分析[J].华北农学报,2014,29(6):78-83.

[4]张育军,胡敏兰,张子军,丁建平,任春环,杨玉敏,阮崇美.山羊GnRHR基因部分序列多态性及其与产羔数的关联性分析[J].中国草食动物,2010(4):13-16.

[5]朱广琴,王庆林,康永刚,等.GnRHR,GDF9,KISS1基因多态性与黄淮山羊产羔性状相关性的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2013(11):18.

贵州省科技重大专项 [黔科合重大专项字 (2013)6008]。

张劲松（1973-），男，贵州省习水县人，研究生，主要从事畜牧水产技术推广。

*通讯作者：陈祥 (1974-)，博士，教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。