基于HS—SPME的超声波辅助提取香椿挥发性成分工艺优化

杨慧+王赵改+史冠莹+梁万平+王晓敏+张乐

摘    要：以中牟棚栽红油香椿嫩芽为试验材料，基于顶空固相微萃取技术（HS-SPME），采用单因素分析结合正交试验对超声波辅助萃取香椿风味物质进行工艺优化，并对萃取物挥发性成分进行分析研究。结果表明，在顶空固相微萃取最优条件为萃取头50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取温度40 ℃、萃取时间30 min的基础上，超声波辅助乙醚法最佳条件为：料液比1∶2，萃取功率240 W，提取温度40 ℃，提取次数3次。风味物质检测结果显示，超声波辅助联合顶空固相微萃取法（HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5）检测出风味物质69种，比HS-SPME法多6种;HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法含量最高的为芳香族/烃类物质（41.83%）和萜烯类物质（22.10%），HS-SPME法则是醛类物质（34.57%）、萜烯类物质（21.88%）和噻吩类物质（12.75%）。

关键词：香椿;顶空固相微萃取;超声波

中图分类号：S644.4         文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.013

Process Optimization of Extracting Toona sinensis Volatiles based on HS-SPME and Ultrasonic-Assisted

YANG Hui1， WANG Zhao-gai1， SHI Guan-ying1， LIANG Wan-ping2， WANG Xiao-min1， ZHANG Le1

（1.Institute of Agricultural Products Processing， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， Henan 450008， China; 2. Institute of Resources and Environment， Zhumadian Academy of Agricultural Sciences， Zhumadian， Henan 463000， China）

Abstract： The Toona sinensis volatiles ultrasonic-assisted extraction process was optimized by single-factor and orthogonal tests based on HS-SPME，and the flavor of extractant was analyzed. The result showed that the optimum conditions of ultrasonic-assisted extraction were as follows： material-to-liquid ratio 1∶2， extraction power was 240 W， temperature 40 ℃，3 times extraction， which was based on 50 / 30 μm DVB/CAR/PDMS as extracting head， temperature 40 ℃and extraction time 30 min of HS-SPME. Flavor compounds showed that 69 species were detected in extractant by ultrasonic-assisted， which was 6 species more than HS-SPME. Aromatic / hydrocarbons （45.92%） and terpenes substances （24.26%） were the main materials in extractant by UWE-C2H5OC2H5 ， while the content of aldehydes （38.14%）， terpenoids （24.14%） and thiophene material （14.07%） was high by HS-SPME.

Key words： Toona sinensis; HS-SPME; ultrasonic

香椿为我国特种资源，其风味独特、营养丰富、味道鲜美，深受广大消费者喜爱[1]。随着香椿蔬菜化栽培的推广，科研人员在选育[2]、繁殖[3]、栽培[4]、采后保鲜[5-6]及贮藏运输等方面开展了广泛研究，虽然香椿独特诱人的香味是衡量其食用价值和商业价值重要品质特性，然而，受技术条件限制，香椿风味物质的研究却较滞后。近年来，随着现代分析手段的发展，关于香椿风味物质萃取的研究日益增多[7-11]，其中有机溶剂萃取法因其操作简单、简便易行、能较真实地反映抽提对象的香气组成等优点，成为常用方法之一[12]。陈从瑾等[13]曾用乙醚超声波法（UWE-C2H5OC2H5）提取香椿干粉中挥发油，得到暗绿色稠状物，此外关于有机试剂法萃取香椿，特别是新鲜香椿风味物质的研究甚少。然而，在实际操作过程中，利用超声波辅助乙醚萃取新鲜香椿嫩芽挥发性成分时，发现萃取物也呈墨绿色粘稠状。根据前人研究，香椿中挥发性化合物复杂多样且研究有限，有成分尚未鉴定出。若贸然直接用GC-MS检测，对仪器和柱子是否有损伤尚不可知。

鉴于此，本试验利用超声波辅助乙醚提取技术协同顶空固相微萃取（HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5），对新鲜香椿嫩芽挥发性成分进行分离提取，以期为香椿挥发性成分提取提供一种新思路和方法，同时也解决香椿萃取物呈粘稠状且成分复杂对柱子造成不可估量的影响这一难题，具有理论和实践双重意义，有助于推动香椿产业向广、深方向发展。

1 材料和方法

1.1 材  料

供试品种为棚栽红油香椿，于2015年3月中旬采自河南省郑州市中牟县田庄村河南省农业科学院香椿示范基地，选取新鲜、健壮、成熟度相对一致、无病虫害和机械损伤的香椿嫩芽进行粉碎后试验。

1.2 仪器与设备

7890AGC -5975CMS 型气相色谱—质谱联用仪，美国安捷伦公司;HP-5MS石英毛细管色谱（30 m×0.25 μm×0.25 μm）;顶空固相微萃取装置（包括手持式手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 萃取头，40 mL棕色顶空瓶），美国安捷伦公司。

1.3 GC-MS分析条件

GC条件：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）;载气He，进样口温度250 ℃，无分流比;柱流速1 mL·min-1;程序升温：初温40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1的速率升温至150 ℃，保持2 min;以8 ℃·min-1的速率升至220 ℃，保持5 min。

MS条件：穿梭线温度230 ℃，电离方式为电子电离（EI），离子阱温度230 ℃，扫描方式全扫描，扫描范围m/z 43～800。检索图库：NIST 2.0。

1.4  试验方法

1.4.1 顶空固相微萃取法条件优化 （1）萃取流程。新鲜香椿、切碎→称取1.0 g于40 mL棕色顶空瓶里→密封垫密封→40 ℃水浴中平衡15 min→萃取头插入顶空瓶中，萃取30 min→立即取出，插入GC-MS解析5 min[11]。 （2）萃取条件优化单因素试验。采用单因素逐步优化的方法对萃取头、萃取时间、萃取温度进行优化[1]。采用萃取头类型有50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3种;采取萃取温度有10，20，30，40，50 ℃等5个梯度;采用萃取时间有5，15，30，45，60 min 5 个梯度。根据不同梯度色谱峰的总面积确定最佳的萃取温度、萃取时间、萃取头类型。

1.4.2  HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法工艺优化 基于顶空固相微萃取最佳条件，优化超声波辅助乙醚萃取法。

（1）工艺路线。新鲜香椿、粉碎→加乙醚，超声萃取30 min→倒出滤液并合并→加入无水Na2SO4干燥过夜→5 000 r·min-1离心20 min→上清液挥去乙醚→萃取物→顶空瓶→顶空固相微萃取→GC-MS。

（2）工艺参数优化。以色谱峰的总面积为响应值，进行单因素和正交试验。

① 超声波辅助乙醚萃取法考察料液比、超声波功率、提取温度、萃取次数5个单因素，设计如下。

A：料液比设1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5等5个水平;

B：超声波功率设60、120、180、240、300 W等5个水平;

C：提取温度设10、20、30、40、50 ℃5个水平;

D：萃取次数设1、2、3、4、5次5个水平。

② 在单因素试验的基础上，选取料液比、功率、温度、萃取次数4个因素和3个水平，以总峰面积为响应值进行L9（34）正交试验，确定最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 顶空固相微萃取条件优化

2.1.1 萃取头的优化 根据极性及涂层厚度的不同，选取50/30 μmDVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3种萃取头进行优化，结果如图1所示。50/30 μm DVB/CAR/PDMS检测出色谱峰数量和面积明显比其它高，表明该类型萃取头具有较大萃取效率。

2.1.2  萃取温度的优化 在最优萃取头基础上进行萃取温度的优化，如图2所示，总峰面积随萃取温度的升高而上升，在萃取温度为40 ℃时，总峰面积最大，为17.7×108，随后当萃取温度升高到50 ℃时，总峰面积降低，推测可能是部分含硫化合物、萜烯类化合物热不稳定的成分分解造成的[1]。

2.1.3  萃取时间的优化 在最优萃取头、萃取温度的基础上进行萃取时间的优化，如图3所示，在5～30 min区间内，峰面积随着萃取时间的延长逐渐增大，随后基本保持不变，表明萃取30 min已达到最大萃取效率，故选30 min是最佳萃取时间。

2.2 HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法工艺优化

2.2.1 单因素试验 料液比、提取功率、提取温度、萃取次数对总峰面积的影响分别如图4所示。图4a中，随着料液比的增大，总峰面积逐渐升高，并在料液比1∶1.5时达到最大，随后变化不大。显示料液比1∶1.5比较合适。图4b中，总峰面积随着超声波功率的增大而增大，在240 W时达到最大值，随后略有下降趋势。故选择功率为240 W较为合适。图4c中，总峰面积随着萃取温度的升高逐渐上升，40 ℃以后总峰面积变化不大，达到最大萃取效率。图4d中，总峰面积对萃取次数的增大逐渐增大，当萃取次数达3次时，总峰面积达到最大，之后达到动态平衡，此时达到最大萃取效率。

2.2.2 正交试验 在单因素最佳条件的基础上，进行4因素3水平L9（34）正交试验，结果见表1。超声波辅助乙醚法最佳条件为A3B2C2D3，即料液比1∶2，提取功率240 W，提取温度40 ℃，提取次数3次。由极差知， 影响香椿风味物质因素的主次顺序为： A>C>B>D，即料液比>萃取温度>功率>萃取次数。

2.3 HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法萃取香椿风味物质分析

2.3.1 香椿风味物质成分鉴定结果 ① 在最优萃取条件的基础上，超声波辅助乙醚协同顶空固相微萃取香椿风味物质总离子的流图如图5a所示，图5b为顶空固相微萃取法总离子流图，两种方法的对比分析结果见表4。经鉴定，超声波辅助乙醚联合顶空固相微萃取法检测出风味物质为69种，比单纯用顶空固相微萃取法多检测出6种，更是比陈丛瑾等[13]用乙醚超声波提取挥发油种类多出30种。

② 两种方法检测出15种共有物质，分别为2-己烯醛、2，4-二甲基噻吩、石竹烯、2，6，6三甲基-1-环己烯-1-甲醛、古巴烯、[1S-（1π4π7π]-1，2，3，4，5，6，7，8-八氢-1，4-二甲基-7-（1-异丙烯基）-薁、π石竹烯、4-亚环己基-3，3二乙基-2-戊酮、[4aR-（4aπ7π8aπ]-十氢-4a-甲基-1-亚甲基-7-（1-异丙烯基）-萘、[2R-（2π4aπ8aπ]-1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氢-4a，8-二甲基-2-（1-甲基乙烯基）- 萘、[1S-（1π3π3aπ4π8aπ]-十氢-1，5，5，8a-四甲基-1，4-Methanoazulen-3-醇、π愈创木烯、5，6，7，7a四氢化-4，4，7a三甲基-2（4H）苯并呋喃酮、1-Heptatriacotanol和喇叭烯氧化物-（II）。

③ HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法萃取香椿风味物质中含量最高的10种物质是1-甲基-4-（1甲基乙基）苯（7.53%）、十一烷（7.2%）、石竹烯（7.01%）、（Z）-3-十一碳烯（6.3%）、1-乙基-3-甲基-苯（6.07%）、薄荷烷（5.49%）、2-十二碳烯-丁二酸酐（3.415%）、十二烷（3.11%）、2.6.10-三甲基正十四烷（3.1%）和2，4-二甲基噻吩（3.05%）;HS-SPME法含量最高的物质是2-己烯醛（5.16%）、2，4-二甲基噻吩（10.69%）、苯甲醛（27.2%）和π石竹烯（3.16%）。此外，HS-SPME法含有HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法所缺少的2-硫基-2-3二氢3，4-二甲基-噻吩（2.06%）。

2.3.2 香椿风味物质种类的构成 香椿萃取物风味物质可以分为以下几类：醛类、噻吩类、萜烯类、醇类、酮类、硫醇类等。2种方法萃取香椿风味物质种类组成相对含量图如图6所示，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法含量最高的为芳香族/烃类物质（41.83%），其次是萜烯类物质（22.10%）;HS-SPME法含量最高的则为醛类物质（34.57%），其次为萜烯类物质（21.88%），最后为噻吩类物质（12.75%）。

3 结论与讨论

（1）基于最优顶空固相条件，萃取头为50/30 μm DVB/CAR/PDMS，萃取温度40 ℃、萃取时间30 min，超声波辅助乙醚法最佳条件为料液比1∶2，萃取功率240 W，提取温度40 ℃，提取次数3次。

（2）HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5和HS-SPME法萃取的风味物质中均含有2，4-二甲基噻吩，但HS-SPME法还含有2-巯基-2，3-二氢-3，4-二甲基噻吩。张杰等的研究表明，2-巯基-2，3-二氢-3，4-二甲基噻吩即为香椿特征香气成分物质，推测在超声波乙醚提取的过程中，2-巯基-2，3-二氢-3，4-二甲基噻吩性质不稳定，是失去巯基（-H2S）造成的。另外，试验检测出的2，4-二甲基噻吩与张杰等检测出的3，4-二甲基噻吩等物质不一样，但可以看出它们互为同分异构体，推测所呈现出来的味道相差不大，有类似于煮熟的洋葱味和硫磺味，其具体生产机理还需进一步研究。

（3）HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法与陈丛瑾检测挥发物质分析研究结果相比，存在5种共有物质，分别是古巴烯、石竹烯、红没药烯、4，4，7a-三甲基-5，6，7，7a-四氢-2（4H）-苯并呋喃酮与愈创木烯。两法主要物质不同，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法检测的主要物质是芳香/烷烃和萜烯类，而超声波辅助乙醚法为未知物、棕榈酸、亚油酸及其氧化物等。此外，物质香气不仅取决于成分的种类和含量，还与其感觉阈值和相互作用密切相关[14]，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法提取的风味物质中存在超声波辅助乙醚法中缺少的2，4-二甲基噻吩，该物质的气味强度仅次于香椿特征香气，阈值较高。

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