葛根芩连汤对慢性牙周炎合并动脉粥样硬化大鼠TNF-α水平的影响*

李文娟，彭 伟，王 丹，方 谦，周 雪

河北联合大学口腔医学院唐山063000

△女，1987年6月生，硕士研究生，医师，研究方向:口腔内科学，E-mail:562649611@qq．com

近年来慢性牙周炎和心血管疾病的关系备受关注。资料［1］表明，冠心病和外周动脉粥样硬化的患者口腔卫生不良率和牙周炎患病率均较高，牙周炎患者中冠心病的发病率明显增加。慢性炎症可增加心血管疾病患者动脉粥样硬化的风险，炎症在动脉粥样硬化发生、斑块发展、斑块破裂过程中起着重要作用［2-5］，并在一定程度上决定着粥样硬化斑块的稳定性和自然进程。对于牙周炎目前多采用手术治疗、基础治疗配合药物治疗，但是心血管疾病患者对手术和基础治疗往往不耐受。中药复方制剂因含多种成分，具有多方位的综合效用，如抗菌谱广、高效、低毒、廉价、取材广泛等。作者采用中药葛根芩连汤对慢性牙周炎合并动脉粥样硬化的大鼠模型进行治疗，并观察其对牙周组织及血清TNF-α 水平的影响，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 主要材料 Wistar 大鼠，雄性，体重(200 ±20)g(北京华阜康生物科技股份有限公司);葛根芩连汤合剂:由葛根(批号1110035)、黄芩(批号1202152)、黄连(批号1111019)、炙甘草(批号1112083)中药配方颗粒(葛根15 g、黄芩9 g、黄连9 g、炙甘草6 g，广州一方制药有限公司)组成，唐山市中医医院提供;甲硝唑片(亚宝药业集团有限公司，批号111020)，阿托伐他汀片(北京嘉林药业股份有限公司，批号H20093819);大鼠TNF-α 多克隆抗体(博奥森科技有限公司)，PV-6001 二步法免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);酶标仪、Olympus 显微镜等。

1．2 动物分组及模型建立 40只大鼠采用随机数字表法分为2组:对照组(N组)10只、模型组(D组)30只。D组:将左上颌第二磨牙牙周结扎，高脂饮食辅助药物诱导，持续12 周，建立慢性牙周炎合并动脉粥样硬化模型［6］。N组:不进行上述处理。12 周末N组和D组均处死5只大鼠，HE 染色观察牙周组织和腹主动脉病理变化，验证造模结果。造模成功后将D组大鼠分成5组:盐水治疗组(D1组)、甲硝唑治疗组(D2组)、阿托伐他汀治疗组(D3组)、甲硝唑联合阿托伐他汀治疗组(D4组)、葛根芩连汤治疗组(D5组)，每组5只大鼠。甲硝唑用量0．05 g/(kg·d)，阿托伐他汀用量0．08 g/(kg·d)，葛根芩连汤用量0．42 g/(kg·d)［7］;N组、D1组灌胃生理盐水;所有动物灌胃体积不超过4 mL/(kg·d)，每天灌胃1次，灌胃4 周后，处死所有动物。

1．3 牙周组织和腹主动脉标本采集及HE 染色观察 分别于实验第12、16 周取动物上颌标本，经生理盐水清洗后，40 g/L 多聚甲醛溶液固定48 h 以上，在滴水条件下进行组织修整，放入100 g/L EDTA 脱钙液(pH=7．3)4℃水浴脱钙4 周，常规石蜡包埋，沿牙周组织块颊舌向切片，片厚5 μm。取腹主动脉段置体积分数10%甲醛溶液中保存，石蜡包埋、切片。上述标本分别进行HE 染色，光学显微镜下观察。

1．4 免疫组化法观察牙周组织和腹主动脉中TNFα 的表达 采用免疫组化PV 二步法观察TNF-α 在牙周组织和腹主动脉中的表达，严格按照说明书步骤进行操作，应用Image-Pro Plus 6．0 计算机图像分析系统半定量分析TNF-α 的表达水平。

1．5 血清TNF-α 水平检测 分别于第12 和16 周末时，各组动物禁食12 h，采腹主动脉血5 mL，离心取上清，用ELISA 法检测大鼠血清中TNF-α 水平。严格按说明书进行操作。

1．6 统计学处理 采用SPSS 17．0 进行数据分析，不同组间牙周组织和腹主动脉中TNF-α 的表达水平及血清中TNF-α 水平的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，检验水准α =0．05。

2 结果

2．1 牙周组织和腹主动脉HE 染色结果 见图1。N组:牙龈上皮结构完整，结合上皮、沟内上皮结构正常，牙周膜纤维排列整齐，牙槽嵴处未见骨吸收;血管管壁均匀一致，没有内层增生。D组:牙周炎症破坏明显，结合上皮与牙面分离，上皮向根方增殖，组织深部可见大量炎症细胞浸润，骨小梁稀疏，牙槽骨表面可见骨吸收，牙槽嵴顶高度降低，呈垂直吸收，牙周膜纤维粗细不均或断裂，排列紊乱;腹主动脉内层增厚，管腔明显缩窄，出现动脉粥样硬化斑块。D5组治疗4 周后，牙周组织炎性细胞浸润比D1组明显减少，牙槽嵴吸收程度减轻，牙龈上皮炎症有不同程度的减轻，牙周膜纤维排列较整齐;腹主动脉内膜厚度变薄，增生不明显。D2组、D3组、D4组牙周组织炎症均减轻。

2．2 牙周组织和腹主动脉中TNF-α 的表达 结果见图2、表1。

图1 各组大鼠牙周组织(1)和腹主动脉(2)病理变化(HE，×200)

图2 各组大鼠牙周组织(1)和腹主动脉(2)TNF-α 的表达(PV，×400)

表1 各组大鼠牙周组织和腹主动脉中TNF-α 的相对表达量

2．3 血清TNF-α 水平检测结果 见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α 水平比较 ng/L

3 讨论

葛根芩连汤最早出自汉代张仲景《伤寒论》，是具有祛邪、升清、生津之功效的经典名方。葛根素被广泛应用于心脑血管疾病的预防及治疗［8］，研究［9］还发现其具有促进成骨细胞合成和分泌碱性磷酸酶的作用，同时可以造成体外培养的破骨细胞空泡性变、骨吸收陷窝面积减少等。配方中黄芩的有效成分具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基的作用，并对免疫系统、心脑血管系统有保护作用［10］。Tsao 等［11］研究证实，黄芩煎剂对多种牙周病病原菌有抑制作用;汤亚玲等［12］研究证实，黄芩水浸膏具有抑制牙髓卟啉单胞菌生长、降解LPS 的作用。另有研究［13］发现，黄芩提取物能阻断牙周炎症过程，促进成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的合成，并能明显抑制LPS 引起的炎症反应，促进成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的合成。配方中的黄连含有多种生物碱成分，其中的小檗碱具有预防颈动脉粥样硬化的作用［14］。黄连素通过提高低密度脂蛋白受体的表达而实现降脂作用［15］，在临床上黄连素治疗高脂血症已取得了确切的疗效［16-17］。

在心血管系统疾病中，TNF-α 可以通过改变钙离子平衡、氧化张力、破坏兴奋-收缩偶联等方式导致心肌功能障碍。在牙周病中，TNF-α 可以作为始动因子引发炎症反应;诱导破骨细胞的产生，引发牙槽骨吸收;增加基质金属蛋白酶的生成，破坏胶原纤维;诱发基质细胞凋亡，阻碍牙周组织的修复等等。由于TNF-α 在两种疾病中发挥重要作用，因此以TNF-α 为靶点的治疗十分有意义。中药复方制剂因含多种成分，具有多方位的综合效用。在此实验中，作者选用了西药阿托伐他汀、甲硝唑、甲硝唑联合阿托伐他汀作为对照药，结果显示D5组炎症因子水平低于各西药单纯用药组，与联合用药组治疗效果相似。但是长期使用广谱抗生素和化学合成药在清除致病菌的同时，也会破坏口腔的微生态平衡，导致多种毒副作用。故对于牙周炎合并动脉粥样硬化的慢性炎症性疾病的治疗，选择天然植物药具有良好的应用前景。该实验采用葛根芩连汤对实验大鼠进行干预，结果显示D5组、D2组、D3组以及D4组牙周组织和腹主动脉以及血清中TNF-α 水平均较D1组明显降低。说明葛根芩连汤能降低牙周炎合并动脉粥样硬化模型大鼠TNF-α 水平，对牙周炎合并动脉粥样硬化大鼠有很好的治疗效果，提示牙周炎与动脉硬化同时治疗有利于改善机体的炎症状态及心血管功能。

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