给予CCP 技术的北虫草液体菌种培养工艺的优化试验

钱叶会，叶世森，李 凌

（福建林业职业技术学院，福建 南平353000）

北冬虫夏草，又北虫草、虫草花，草长5～8cm，金黄、桔黄色，是一种名贵的药用真菌，与青海冬虫夏草同属于真菌门虫草属，有相似的药用和滋补功效。国内外对已经成为诱发虫草子实体的种类研究认为，北虫草食用和药用价值可与传统的冬虫夏草媲美。近年来随着野生冬虫夏草资源的枯竭，人工栽培的北虫草其有效成分与冬虫夏草类似，部分活性成分含量甚至高于冬虫夏草，人工栽培的北虫草成为冬虫夏草的理想替代品，这使得北冬虫夏草的开发充满了潜力。液体菌种是食用菌栽培新技术的发展方向，但是液体菌种技术的推广，还存在技术路线难度高、过程控制工艺不够成熟等问题。本文对北虫草液体菌种栽培工艺进行了试验研究，通过实验确定了母种的选择、培养基的制备、培养基的灭菌、接种空间的消毒、摇床培养、发菌管理等阶段的北虫草培养的关键步骤的关键控制点（CCP）的参数和操作方法。

1 种源

本次试验所选的4个品系的菌种，根据食用菌菌种命名规则分别进行命名编号为CM－1、CM－2、CM－3、CM－4，所有菌种的母种的转代次数不得超过3次。

2 母种的选择

2.1 母种转管实验

母种培养基配方和制备方法如下：马铃薯200g，琼脂20g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g。制备好马铃薯滤液，加蒸馏水至1 000mL煮沸加入各种辅助物质，最后加入琼脂，并不停地搅拌使琼脂完全融化，高压蒸汽灭菌0.1～0.12MPa、121℃、30min。

每个菌种接种40支，置于18℃培养箱暗培养12h升温到24℃培养，湿度自然，无光照。每天观察1次，观察并统计菌种生长速度，气生性、色泽、长满斜面时间，最后通过显微镜观察是否有杂菌孢子及其菌丝。从发菌时间、菌丝生长情况、长满斜面时间和转色速度等对母种培养生长情况进行评估，结果见表1。

表1 母种培养生产情况记录表

2.2 子实体生长实验

2.2.1 培养基配方

选用成分较为综合的培养基（本文中所有百分比含量均为质量百分比）：大米99%，磷酸二氢钾0.15%，VB1每千克大米5片，蛋清0.85%，料水质量比1∶1。

2.2.2 实验方法

2.2.2.1 培养方法

接种后将最初的培养温度保持在15～18℃，遮光培养。当菌丝生长至培养基一半时，可将温度升至24℃，培养20d，当培养基上部出现密集的菌丝突起时，就给予10～15℃的温差刺激，并增加可见光照射刺激转色。7～10d转完色后用紫外灯对培养室进行30min光照消毒，然后揭开栽培瓶盖子改用消毒的橡皮筋和塑料薄膜封口，当子座长至1cm时，在封口薄膜上打小孔通气。温度保持18～22℃，空气相对湿度80%～90%。

2.2.2.2 性状比较分析

每个菌种接种每次接种培养20瓶，重复3次。待棒状子座成熟后采摘下进行烘干计算干重。本阶段所要记录数据为：生长周期、生长速度、子座密度、整齐度、产量。以生长周期最短，产量最高，虫草品相以长度、密度、整齐度为分级统计，得到不同菌种栽培性状观察表见表2。

表2 不同菌种栽培性状观察表

根据培养结果，CM－1菌种从菌丝培养到子实体均表现出优良的性状，其中通过子实体生长试验验证CM－2型子实体属于大孢子头型，另行安排试验计划，CM－3和CM－4的综合性状最劣，故选用CM－1进行液体菌种培养试验。

3 液体培养基的选择

3.1 培养基配方

液体培养基的配方主要选择了3种报道过的配方进行对比，筛选确定最优配方：配方一（%）：玉米粉1%、葡萄糖2%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、水95.35%、硫酸镁0.5%、磷酸二氢钾0.1%、pH值调至6.5左右。配方二（%）：马铃薯10%、蔗糖2%、牛肉膏0.5%、蛋白胨1.5%、磷酸二轻氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、维生素B22片／L、B11片／L。配方三（%）：马铃薯20%、玉米粉3%、葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、pH值调至6.5左右。

3.2 实验方案

以上3组配方，各制备培养基3 000mL，分别分装菌种培养摇瓶10瓶，每瓶接入LN－1试管中1／3支，在24℃，静止培养24h后，放置于24℃摇床内，130r／min，恒温摇床培养5d。

3.3 结果分析

根据对菌丝体萌发时间、菌球出现时间、菌球数量进行统计，得到菌种在培养阶段生长情况，见表3。

表3 液体菌种生长记录表

通过对菌球大小和菌丝体干重的测定得到液体 菌种培养生长量数据，见表4。

表4 液体菌种生长量记录表

以上各项最高数值为“＋＋＋”，其次为“＋＋”，最低为“＋”，以一个“＋”得1分，进行计算，得出综合分析比较表5。

表5 综合分析比较表

从表5不难看出，配方一综合评定得分为14分，其余2个配方综合评定得分均为8分，所以配方一是3个培养基配方中综合性能最优的配方组合。

4 高压灭菌条件的优化

4.1 实验方案

为了达到彻底灭菌的效果，本方案选择高压蒸汽灭菌法，根据相关资料灭菌条件设定为3个值，具体见表6。

表6 高压蒸汽灭菌条件

4.2 结果分析

每组方案各配制6瓶培养基进行灭菌操作，灭菌完成后通过对pH值下降情况和灭菌情况进行检测得出的结果见表7。根据结果分析，方法1出现了灭菌不彻底的情况，方法2和方法3均能起到灭菌的彻底性，再次根据pH值的下降情况，并同时考虑高温长时间对培养基营养成分的破坏作用，进而导致培养基营养价值的降低，所以，综合以上因数考虑，方法2，在0.05MPa时排冷气是在本6个方案中最优的方案组合。

表7 灭菌效果检测表

5 摇床培养条件的优化选择

5.1 设备选择

本方案选用的摇床型号为BDY－2102恒温摇床。

5.2 方案制定

根据设备性能和液体菌种培养的振幅需求，选用培养温度24℃，振幅设为3种：1）低速档90r／min；2）高速档140r／min；3）每天观察3次，根据培养瓶内泡沫生产情况和液体震动幅度，随时调换震动幅度。各个方案选择培养基10瓶，每瓶溶液体积为300mL。

5.3 结果分析

在相同的培养时间内，培养结束后，根据培养液表面泡沫多少、菌球大小、菌球数量和污染情况来对振幅大小进行判断，得到数据表8。

通过对实验过程的观察和结合以上数据的分析，方案①由于震动幅度偏低，所生成的菌球偏大，且大小不是非常均匀，个别菌球直径甚至达到了10mm，并且个数偏少。方案②由于震动幅度偏大，震动过程中形成了大量起泡，同时由于培养液的飞溅，导致部分瓶塞和瓶口会渗透出培养液而出现污染现象。方案③，由于通过不停的观察，根据实际需要选择震动幅度，能很好地控制培养瓶溶液的震动幅度和泡沫的生成幅度，并促进了菌球直径的均匀性和大小的适宜，根据观察结果发现震动幅度在120r／min±10之间调整即可，当然相比较前面的2种，方案③因为要不停观察，所以消耗时间较多，综合所有因素考虑，本实验中方案③为最优方案。

表8 液体菌种发酵结果情况表

6 栽培培养基的优化选择

6.1 栽培配方的选择

本实验方案在综合有关资料的基础上并结合生产成本和原料获得的难易程度，选择了3个培养基配方：配方一：大米100%，料水质量比1∶1.1；配方二：小麦100%，料水质量比1∶1.1；配方三：大米99%，磷酸二氢钾0.15%，VB1每千克大米5片，蛋清0.85%，料水比1∶1。

各个配方制作3kg培养基三批制备培养基，接种培养，接种的菌种为每瓶菌种接种10瓶，每瓶培养基培养料干重30g。每配方培养基接种100瓶，重复3次，即每个菌种有300个重复。

6.2 实验结果分析

通过观察记录，得到菌种栽培形状观察表9。

根据实验结果，配方一和配方二从每瓶出草根数、产量和品相判断效果相当，配方三由于添加了蛋清，N含量较高，导致菌丝体生长浓密，原基生产困难，单根虫草直径偏大，综合考虑培养料的获取性，选择配方一作为栽培培养基配方

表9 不同菌种栽培性状观察表

7 栽培方法优化

通过以上2个方案选择最优菌种和最优培养基进行培养方法优化：主要控制指标为培养温度、分化温度和温差、光照时间和光强（说明：以下所有实验使用样品为每瓶培养基干重30g）。

7.1 发菌温度的优化

培养温度优化：培养温度对比，3个对比，每组40瓶则40个重复，于生化培养箱培养分别设置培养温度为19℃，22℃，24℃，每天观察记录菌丝生长速率。通过观察，得到如下菌丝体生长数据表10。

表10 菌丝体生长记录表

7.2 转色管理

1）每天散射光照12h、10h、8h各一组，晚上用日光灯补照射3h和5h和不补照各一组，共9组；

2）室内温度白天22～24℃，夜间降低2～5℃；

3）室内空气湿度控制在65%左右；

4）通气2～3次／d，通气20min／次，待菌丝由白色转为桔黄色或橘红色后并陆续纽结成长出原基，分泌出来黄色的水珠，就可以进行生长北虫草子的准备工作。

通过观察记录，得到转色管理记录表11。通过观察，北虫草在自然光照射12h，24h内即可完成转色，夜晚可以不安排补照射灯光。

7.3 分化温度和温差优化

相同温度培养同一批菌种分3组各40瓶，等菌丝发满后分别予以8℃、10℃和15℃的温差，光照时间和光强控制相同，记录转色时间和子座出现时间和整齐性以及子座密度，通过观察得到菌丝体转色和分化记录表12。

表11 转色管理记录表

表12 菌丝体转色和分化记录表

通过对分化温差的控制和数据的统计分析，得出15℃分化温差效果最好。

8 结语

本研究通过实验验证北虫草液体菌种工艺中各个步骤的参数和操作方法，确定了菌源LN－1，培养液体菌种的培养基为葡萄糖2%、玉米粉1%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、水95.35%、硫酸镁0.5%、磷酸二氢钾0.1%、pH值调至6.5左右，灭菌条件为121℃，40min，在压力到0.05MPa时排冷气，摇床震荡培养在120r／min±10之间根据观察结果进行调整，培养温度24℃，转色光照散射光每天照射12h，照射2d，原基诱导温差15℃为最优培养条件。通过本研究可以为进一步制定北虫草栽培的标准化栽培甚至是构建北虫草液体菌种栽培工艺的HACCP计划提供参考依据。

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