外源磷素对药用植物三七吸收砷的微区及形态分布特征影响

陈璐，米艳华*，万小铭，尹本林，袁志伟，和丽忠

1. 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650221；2. 中国科学院地理科学研究所与资源研究所，北京 100101；3. 昆明医学院第二附属医院，云南 昆明 650101

外源磷素对药用植物三七吸收砷的微区及形态分布特征影响

陈璐1，米艳华1*，万小铭2，尹本林1，袁志伟3，和丽忠1

1. 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650221；2. 中国科学院地理科学研究所与资源研究所，北京 100101；3. 昆明医学院第二附属医院，云南 昆明 650101

三七是中国特有的珍稀药用植物，其生长环境受地域、气候、土壤等条件的限制，仅云南省文山州三七产量高、品质好。但由于矿业开采、工业生产等因素使得土壤砷的背景值超标，逐渐威胁三七的正常生长及其产品质量。因此，如何降低三七砷污染是目前迫切需要解决的问题。磷与砷具有相似的结构和理化性质，利用磷与砷在土壤中的拮抗效应，达到控制土壤砷危害的效果。本研究利用同步辐射X射线荧光方法（SRXRF）和高效液相色谱-原子荧光联用技术（HPLC-HG-AFS）相结合对参试三七植株进行分析测定，从细胞微区组织层面揭示药用植物三七在外源磷素作用下吸收As和P的相对含量分布规律和三七植株各部位的砷形态及含量特征，以及各部位的生物转运系数及富集系数的变化。结果表明：磷和砷在三七主根部的相对含量荧光分析中保持分布规律一致的特性，说明三七根部吸收磷和砷的点位相同；添加外源磷素处理可以有效降低三七各部位三价砷和五价砷的含量，最大降幅达 50%，同时可以降低根部对砷的吸收富集系数；试验中仅添加五价砷元素，但在三七植株各部位均检出三价砷，说明三七体内存在着砷还原机制；其中茎部的三价砷的含量均高于五价砷，推测茎是三七体内砷还原反应的主要场所。

三七；砷形态；μ-SRXRF

砷是一种有毒、致癌的类金属元素。人类的活动使环境中的砷通过水体、土壤、植物系统，经由食物链进入人体，直接危及人类健康（邓天龙等，2005）。磷是植物生长的必需元素之一，由于其与砷具有相似的生物化学性质，因此对磷元素的关注有助于对砷的毒性研究（卢聪等，2013；Karadjova et al.，2008）。Hellweger et al.（2003）提出在磷为限制因子时，藻类对 As(V)的吸收与磷的吸收率有关，外部磷浓度的增高可减少细胞对As(V)的吸收，从而降低砷的细胞毒性（Wang et al.，2013；Pigna et al.，2010；Wang et al.，2009）。

三七[Panax Notoginseng (Burkill) F. H. Chen ex C. H. Chow]是中国名贵药材之一，具有散瘀止血，消肿定痛等功效。其根部位是主要药用部位，一旦药用部分重金属含量超标，重金属易在人体内蓄积而引发毒性。已有研究表明，砷的毒性效应与总量无显著关系，而是与砷的形态有关（雷鸣等，2014）。通过前期大量调查分析，部分三七种植区由于产地土壤As含量过高（陈璐等，2014），不仅导致三七主要药用部位——主根的健康风险增加（阎秀兰等，2011）；还会对三七的药用质量安全和出口贸易造成较大的影响。本研究以采自人工种植区的药用植物三七为主要研究对象，采用同步辐射X射线荧光分析（μ-SRXRF）技术测定植物样品中的元素含量，并进行微区分布扫描；应用高效液相色谱-原子荧光联用技术（HPLC-HG-AFS）测定植株样品中As的含量及其赋存形态，分析了三七植株砷含量特征和As形态分布规律以及外源磷素的添加与三七植株吸收砷的相关性，为进一步研究三七抗砷污染方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物培养

选取试验基地生长环境良好，生长一致（株高、茎粗、叶面积等基本相同）并且植株健壮的一年生三七幼苗进行不同As质量浓度的水培试验，添加砷化合物为 Na2HAsO4·12H2O。水培试验采用“完全营养液”配方（冯光泉等，2003），并结合三七生长特性进行了适当改良，配制营养液的试剂均为分析纯。在As处理前10 d进行预培养，期间每3天更换营养液1次，试验处理3 d取样。设置5个处理：（1）CK（不添加砷）；（2）低砷处理25 mg·L-1；（3）高砷处理50 mg·L-1；（4）低砷添加外源磷素处理（As25 mg·L-1+P100 mg·L-1）；（5）高砷添加外源磷素处理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）。各处理3次重复，置于遮阴避光、透光率在8%～12%、温湿度适宜、通风条件较好的环境中进行培养，每天向水培试验中充氧，以保证三七正常生长所需。

1.2 X射线吸收光谱分析

由于检测机时申请受限制，不能将全部处理样品制片检测，因此选取试验设置中空白（CK）、高砷（As50 mg·L-1）和高砷添加外源磷素（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）3组试验处理的新鲜三七幼苗的主根制片进行检测。选用进口包埋剂OCT(Optimum cutting temperature compound)将幼苗的主根包埋后，在 LEICA CM1950冷冻切片机-20 ℃下切片（Ager et al.，2002），切片厚度为10 μm。将冷冻切片用迈拉膜固定在样品框上，在-80 ℃冷冻干燥后用于 μ-SRXRF扫描。μ-SRXRF分析在北京正负电子对撞机同步辐射实验室（BSRF）4W1B应用微束光束线站进行。试验条件：储存环电子能量为2.5 GeV，束流强度为150～200 mA，调节水平和垂直两个狭缝，使入射光斑大小为20 μm×20 μm，探测器为Si（Li）固体探测器及能谱仪系列。样品与入射光线成 45°，扫描步长为200 μm，每个扫描点的时长为60 s。同步辐射X荧光射线微束激发三七样品的能量数据，在归一化处理后，使用 PyMCA软件进行荧光数据处理，OriginPro 8.0软件绘制As元素分布图。

1.3 植株体内As形态测定

同时采集试验全部处理的三七幼苗根、茎、叶样品，清洗后将样品冻干至恒重，在冷冻条件下研磨，保存于4 ℃下备用。植物样品中加入7 mL浸提剂，浸提剂选用甲醇/水（1∶9）；60 ℃下，超声2 h，5000 rmp，离心20 min，转移上清液；残渣重复以上步骤2次，收集上清液定容至50 mL，设置3个平行样（马杰等，2012）。定容后的样品用0.45 μm的醋酸纤维滤膜过滤，保存于4 ℃下待测。利用高效液相色谱-原子荧光联用仪（科创海光AFS-9800）对待测液中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和有机等其他形态As进行检测。检测所得数据使用SPSS 13.0进行分析。生物转运系数和富集系数按照如下公式计算。

生物转运系数=地上部分的重金属含量/地下部分的重金属含量；

生物富集系数=植物体内的重金属含量/土壤中（沉积物中）的重金属含量

2 结果分析

2.1 As在三七主根部微区分布特点

从不同处理三七主根部横切片As元素分布图（图1右侧）中可以看出，CK处理根部As的相对含量最低，平均在4.6左右，最高不超过5.9；图中红色代表检测扫描区域As的相对含量较高（超过11.64），As50 mg·L-1处理根部As相对含量出现了明显的增加，红色高 As含量区域的数量及范围都出现显著的增加，且砷含量在7～10之间，约是CK处理的 2倍；高砷添加外源磷素处理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）根部的As含量最高检测值为7.25，低于As50 mg·L-1处理的含量，且平均含量在5.3左右，仅比CK处理略高。说明添加外源磷素可以有效降低As在三七主根部的含量。

分析磷元素分布图（图1左侧），CK处理根部P的平均相对含量在4～6.5，对应砷含量较高区域的磷素含量也相对较高，在7.8～8.5之间；As50 mg·L-1处理检测出的磷元素相对含量分布与砷元素分布呈对应关系，且高砷含量区域大多在6.0以上；添加外源磷素处理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）根部磷元素含量基本保持在5.7～8.0之间，相比CK和As50 mg·L-1处理磷元素含量分布得更加均匀。综合分析三七根部As和P的相对含量分布荧光图，得出As50 mg·L-1试验中主根部的砷含量明显增加，添加外源磷素处理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）主根部砷相对含量降低了，说明添加外源磷素可以有效降低As在三七主根部的含量；三七主根部磷元素含量在As50 mg·L-1处理时呈大面积增加的趋势，As50 mg·L-1+P100 mg·L-1处理中这一趋势表现更加显著，说明磷和砷元素的相对含量在三七主根部具有分布区域和规律保持一致的特点。

2.2 不同处理三七各部位间As形态分布特征

不同处理三七根、茎、叶中三价砷和五价砷的含量不同（图2）。试验处理培养液中仅添加五价砷，参试三七中均检测出三价砷和五价砷，说明在三七体内存在着砷的还原机制可以将五价砷还原成三价砷。CK处理各部位中三价砷和五价砷的含量近似为零；高砷处理（As50 mg·L-1）三价砷和五价砷在根、茎、叶中的含量均表现为最高；各部位三价砷和五价砷的含量均表现为根>茎>叶，同时单独砷处理约是添加外源磷素处理的 1倍。As25 mg·L-1处理根部的砷含量明显高于茎、叶部，与 As25mg·L-1+P100 mg·L-1相比各部位砷含量较高，但根部五价砷含量相差不大；As50 mg·L-1+P100 mg·L-1与As50 mg·L-1处理相比根、茎、叶中砷含量的降幅较大，根部五价砷的降幅最大约300 mg·kg-1；除CK外的所有处理茎部均呈现三价砷含量高于五价砷的情况，这可能是由于茎承担着运输养分及能量转移的功能，使根部的砷随着养分向上迁移，而叶片的砷随着能量向下运输，在此聚集所致；同时茎部可能也存在大量的砷还原基质。总体来看，无论三价砷还是五价砷根部的含量都是最高的，这与前期研究保持一致（陈璐等，2014）。在试验处理中仅添加五价砷元素，但在根、茎、叶中均有三价的砷检出，说明三七体内存在着大量的砷还原机制，危害植物生长；其中茎的表现尤为明显，所有试验处理的三价砷的含量均高于五价砷，茎可能是三七体内砷还原机制的主要场所，但这还需要进一步的试验来证实。

图1 不同处理三七主根部横切片中As元素分布图Fig. 1 The Arsenic distribution in P. Notoginseng root cross sections of different processing

对不同处理三七茎、叶的生物转运系数和根部的富集系数分析。按照三七植株由上至下顺序分析，见表 1，叶片中三价砷的生物转运系数 As50 mg·L-1处理表现最高为0.212，As25 mg·L-1和As25 mg·L-1+P100 mg·L-1处理之间没有显著差异；五价砷则表现为单独砷处理（As25 mg·L-1和As50 mg·L-1）的生物转运系数低于添加外源磷素处理（As25 mg·L-1+P100 mg·L-1和As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）；不同试验处理茎部三价砷的生物转运系数无显著差异，五价砷的生物转运系数除As25 mg·L-1+P100 mg·L-1最低为0.093外其余处理均无差异；根部三价砷和五价砷的生物富集系数物均是 As50 mg·L-1+P100 mg·L-1处理显著低于其他处理。因此添加外源磷素可以有效降低三七根部对砷的吸收富集，但对砷在三七植株体内的转运影响不明显。

图2 不同处理三七各部位的As形态含量Fig. 2 Different concentrations of each part of the deal with P. Notoginseng arsenic content in form

3 讨论

早期的研究表明，在高磷浓度下，植物中PO43-与AsO43-竞争膜转运蛋白，两者之间表现为拮抗作用（Sharples et al.，1999）。水稻（Meharg et al.，1990）、大麦（Asher et al.，1979）、苜蓿（Khattak et al.，1991）等普通植物以及砷耐性植物绒毛草（Meharg et al.，1994；Meharg et al.，1992；Meharg et al.，1994），增加磷素添加量可降低其根系、茎叶和籽粒中的砷浓度。超富集植物蜈蚣草在高磷处理时磷与砷表现为协同（促进）作用，施磷有助于植物对砷的吸收和累积（陈同斌等，2002）。本研究通过对相同处理三七根部砷和磷的相对含量分布图的比较，发现同一组试验中砷含量较高区域对应的磷元素的含量也相对较高，这一趋势在高砷（As50 mg·L-1）处理中的表现尤为明显。这可能是磷与砷具有相同的竞争吸附位点（雷梅等，2003；Wang et al.，2009），植物在吸收磷素养分的同时也吸收了砷，导致砷和磷元素在三七根部的相对含量分布情况保持一致。添加外源磷素处理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1），三七根部的砷含量明显降低，相应的磷元素没有呈明显的增加，但相比CK和As50 mg·L-1处理根部的磷元素含量分布更为均匀，这可能是外源磷素的存在抑制了三七根系对砷的吸收，增强了对As(V)的还原、降低硫醇/疏基形成作用，从而起到解毒作用（Tu et al.，2004）。

表1 不同处理三七各部位的生物转运系数及富集系数表Table 1 The transfer coefficient and bioconcentration factors of various P. Notoginseng parts in different concentrations of arsenic

高砷处理（As50 mg·L-1）的三价砷和五价砷在根、茎、叶中的含量表现为最高；在高砷处理中添加外源磷素（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）根、茎、叶中的三价和五价砷出现了明显下降；低砷处理中也有相似的表现。总体来看，无论三价砷还是五价砷根部的含量都是最高的，这与前期研究保持一致（陈璐等，2014）。许多研究表明，As(Ⅲ)对植物的生长抑制效果明显大于 As(V)（Carbonell-Barraehina et al.，1998；Sachs et al.，1971；Marin et al.，1992），而植物体内的砷以 As(Ⅲ)形态存在可以避免 As(V)对氧化磷酸化过程的破坏，一些学者认为，植物体内As(V)向As(Ⅲ)的转化可能与植物体内谷胱甘肽类的还原性硫醇类物质有关，这些物质可以通过脱硫反应将 As(V)转化为 As(Ⅲ)（Pickering et al.，2000；Delnomdedieu et al.，1993）。在药用植物三七主根部砷的主要检出形态是三价砷和五价砷，说明三七体内可能存在着具有还原性的酶或是硫醇类物质。

4 结论

本研究利用μ-SRXRF技术分析三七根部As和P的相对含量分布荧光发现，As50 mg·L-1试验中主根部的砷的相对含量明显高于添加外源磷素处理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1），说明添加外源磷素可以有效降低 As在三七主根部的含量；且 As50 mg·L-1处理主根部磷元素的相对含量出现大面积的增加，这一趋势在As50 mg·L-1+P100 mg·L-1处理中表现得更加显著，结合对生物转运系数和富集系数的分析得出，磷元素和砷元素根部具有相同的吸附位置，且三七生长环境中磷元素大量存在会抑制根部对砷的吸收，也就是说添加外源磷素可以有效降低三七根部对砷的吸收富集。

本试验处理中仅添加五价砷元素，但在根、茎、叶中均有三价的砷检出，说明三七体内存在着大量的砷还原机制；其中所有试验处理茎部的三价砷的含量均高于五价砷，茎可能是三七体内砷还原机制的主要场所，但这还需要进一步的试验来证实。

致谢：

本文部分试验内容得到北京正负电子对撞机国家实验室BSRF的4W1B应用微束光束线站的支持；μ-SRXRF数据处理得到中国科学院高能物理研究所多为老师指导和帮助，在此一并致谢。

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Effect of Micro and Morphology Distribution of Panax Notoginseng Uptake of Arsenic with Exogenous Phosphorus

CHEN Lu1, MI Yanhua1*, WAN Xiaoming2, YIN Benlin1, YUAN Zhiwei3, HE Lizhong1
1. Agri-Food Quality Standard and Testing Technology Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650221, China; 2. Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, CAS, Beijing 100101, China; 3. The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101, China

Panax Notoginseng is China’s unique rare medicinal plants, its growth environment by region, climate, soil and other conditions, but its only in Wenshan of Yunnan Province have high yield and good quality. However, due to mining, industrial production and other factors, the background value of soil arsenic exceeded, and gradually threatened the normal growth and product quality of P. Notoginseng. Therefore how to reduce arsenic accumulation in P. Notoginseng is urgent. Structurally similar phosphorus and arsenic have similar physical and chemical properties, the use of antagonistic effect of phosphorus and arsenic in the soil, to control soil arsenic hazard effect. This study by synchrotron radiation X-ray fluorescence (μ-SRXRF) method and high performance liquid chromatography-combination of atomic fluorescence spectrometry (HPLC-HG-AFS), from the micro cell tissue area level reveal P. Notoginseng medicinal plants under the effect of exogenous p adsorption of arsenic distribution rule and P. Notoginseng characteristics of arsenic form and content in different parts of the plant, and the change of the biological transport coefficient and the enrichment coefficient of the various parts. The results showed that distribution characteristics of phosphorus and arsenic in the main root of P. Notoginseng fluorescence analysis was the same and description of P. Notoginseng root uptake of phosphorus and arsenic level the same. Addition of exogenous phosphorus treatment can effectively reduce the content of P. Notoginseng parts of the trivalent and pentavalent arsenic, the largest decline of 50%, also can reduce root absorption of arsenic enrichment coefficient. Test adding only pentavalent arsenic, but in all parts of the plant P. Notoginseng trivalent arsenic were detected, indicating that there are a lot of P. Notoginseng body arsenic reduction mechanism. The content of trivalent arsenic stems were higher than pentavalent arsenic, stems are the main places in P. Notoginseng of arsenic reduction mechanism.

Panax Notoginseng; Arsenic speciation; synchrotron radiation X-ray fluorescence (μ-SRXRF)

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.09.023

X592

A

1674-5906（2015）09-1576-06

陈璐，米艳华，万小铭，尹本林，袁志伟，和丽忠. 外源磷素对药用植物三七吸收砷的微区及形态分布特征影响[J]. 生态环境学报, 2015, 24(9): 1576-1581.

CHEN Lu, MI Yanhua, WAN Xiaoming, YIN Benlin, YUAN Zhiwei, HE Lizhong. Effect of Micro and Morphology Distribution of Panax Notoginseng Uptake of Arsenic with Exogenous Phosphorus [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(9): 1576-1581.

国家自然科学基金项目（21267024）；云南省科技计划青年项目（2014FD063）；云南省创新人才培养计划项目（2014HB059）

陈璐（1984年生），女，研究实习员，硕士，研究方向为农产品质量安全。E-mail: clcc_006@163.com *通信作者。

2015-04-28