GC-TEA法测定卷烟主流烟气TSNAs前处理方法的改进

张霞，朱东来，韩熠，雷萍，杨光宇，巩效伟，李寿波，段沅杏，韩敬美，陈永宽

新型烟草制品研究所，云南中烟技术中心，昆明，650231

GC-TEA法测定卷烟主流烟气TSNAs前处理方法的改进

张霞，朱东来，韩熠，雷萍，杨光宇，巩效伟，李寿波，段沅杏，韩敬美，陈永宽

新型烟草制品研究所，云南中烟技术中心，昆明，650231

为改进气相色谱-热能分析联用法（GC-TEA）法测定卷烟主流烟气TSNAs的前处理方法，依托改良的索氏提取器将原方法中的提取、浓缩、柱层析净化、再浓缩四步有机结合，然后对卷烟主流烟气中的TSNAs进行测定。结果表明：①在10～ 4000 ng/mL的浓度范围内，4种TSNAs回归曲线的线性相关系数均大于0.999，该方法检测限在0.12～0.15 ng/cig之间，回收率在92.0%～102.3% 之间，日内相对标准偏差在3.06%～5.80% 之间，日间相对标准偏差在3.40%～6.93% 之间；②将本方法与CORESTA N° 63方法进行比较，两者结果无显著性差异。本方法采用改良的索氏提取器进行样品前处理可避免多次转移、浓缩，简化了操作步骤，缩短了前处理时间，有效减少分析误差，且有机溶剂用量大大减少，减少了对环境的污染，结果准确可靠，适用于主流烟气中TSNAs的分析检测。

改良的索氏提取器；气相色谱-热能分析联用法；主流烟气；烟草特有亚硝胺

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是卷烟烟气中可能会诱发癌症的主要活性成分之一[1-2]，主要包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-（甲基亚硝基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)等。国际癌症研究机构（IARC）确定NNN、NNK致癌性等级为I类，NAB、NAT致癌等级为3类[3-7]。随着人们对吸烟与健康问题的关注，卷烟产品的安全、卫生越来越得到各方面的重视，因此，测定卷烟烟气中TSNAs的释放量具有重要的意义。

由于烤烟型卷烟主流烟气中的TSNAs浓度很低，一般均在ng/支数量级，而且卷烟主流烟气样品背景复杂，化学成分繁多，要准确定性定量测定TSNAs难度很大。目前，检测卷烟主流烟气中TSNAs的分析方法主要有气相色谱-热能分析联用法(GC-TEA)[8-9]、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)[10-12]和液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)[13-14]等。LC-MS/MS法具有较高的灵敏度，但基质效应对分析物造成不利影响。GC-MS法重现性较好，但样品前处理非常麻烦。GC-TEA法对亚硝胺类化合物具有很好的选择性，测定结果准确，但样品前处理非常复杂、耗时较长，需多次的转移、浓缩，易造成TSNAs的损失和转化，影响测定的准确性，而且有机溶剂（二氯甲烷）消耗量很大，样品前处理过程中大量溶剂向空气中散发，环境污染大。针对现有技术的不足，本文依托改良的索氏提取器[15]对现有的GC-TEA法测定卷烟主流烟气TSNAs的前处理方法进行了改进，简化了样品前处理操作步骤，显著减少了前处理过程中有机溶剂用量，避免了样品处理过程中的环境污染。测定结果与CORESTA N° 63方法进行了对照，结果无显著性差异。

1 实验部分

1.1 材料

参比卷烟2个(1R5F和2R4F)；国内市售卷烟15个（其中烤烟型卷烟10个，混合型卷烟5个）。

1.2 仪器的结构与流程

改良的索氏提取器具体结构见图1，该装置由回流冷凝管1、提取器3和烧瓶8三部分组成，烧瓶8的底部设有一段1～2 mL的尾管7，提取器3是由溶剂汽流管4和填料管15上部相连而成的U形管，溶剂汽流管4下端接烧瓶磨口5，填料管15中装有筛板11。填料管15上端接回流冷凝管1，下端的管件通过三通阀10后接于烧瓶8，三通阀10的另一出口接溶剂回收口9，回流冷凝管1的液滴出口垂直正对填料管15上方。

提取器3为异径的U形管，溶剂汽流管4的管径为18～22 mm，填料管15的管径为30～35 mm，提取器3与回流冷凝管1相接的磨口2至填料管底部的距离为160～200 mm。

筛板11上放置柱层析材料氧化铝层12和无水硫酸钠层14，氧化铝层14的厚度为50～70 mm，直接放置在筛板上，样品层13置于氧化铝层和无水硫酸钠层之间。烧瓶7中加入溶剂6，加热回流时溶剂6通过三通阀10回到圆底烧瓶8，转动三通阀10至溶剂回收口9，溶剂6则可从回收出口流出。

图1 改良的索氏提取器的结构图Fig.1 Structure diagram of improved soxhlet extractor

1.3 仪器与试剂

氯仿（色谱纯）：美国sigma公司；无水甲醇（分析纯），无水硫酸钠（分析纯），丙酮（分析纯），碱性氧化铝（200目～300目）：国药集团化学试剂有限责任公司；N-戊基-（3-甲基吡啶基）亚硝胺、NNN、NAT、NAB、NNK纯品（纯度大于97%）：百灵威化学试剂公司。

分析天平（感量0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司）；RM200转盘式吸烟机（德国Borgwaldt公司）；92mm剑桥滤片（英国Whatman公司）；气相色谱-热能分析联用仪（美国Thermo Electron公司）；色谱柱，弹性毛细管柱30 m× 0.53 mm× 1 μm，固定相为50%甲基-50%苯基聚硅氧烷；保护柱，弹性石英毛细管柱 1m × 0.53mm，经脱活处理。

1.4 标准工作溶液

按下列浓度范围配制TSNAs标准系列工作溶液，以氯仿为溶剂，内标N-戊基-（3-甲基吡啶基）亚硝胺的浓度为400 ng/mL。

NNN，NAT，NNK：20 ng/mL，100 ng/mL，500 ng/mL，1000 ng/mL，2000 ng/mL，4000 ng/mL。

NAB：10 ng/mL，50 ng/mL，200 ng/mL，500 ng/mL，1000 ng/ mL，2000 ng/mL。

1.5 样品前处理

采用20孔道转盘式吸烟机抽吸卷烟，根据GB/T 19609—2004规定的方法[11]采用92 mm剑桥滤片捕集20支卷烟主流烟气的总粒相物。

在改良的索氏提取器中加入15 g碱性氧化铝层，将剑桥滤片折叠后放在碱性氧化铝层上面，再在滤片上面铺2.5 g无水硫酸钠；在烧瓶中加入150 mL丙酮与氯仿（V:V=2:8）的混合溶剂，再加入1 mL内标溶液，然后将改良的索氏提取器放入水浴锅中在75℃下加热回流40 min，直至烧瓶尾管中的样品溶液约为1 mL。将收集到的样品溶液转入2 mL样品瓶，按GB/T 23228—2008规定的GC-TEA分析条件进行检测。

1.6 仪器条件

本方法所采用的是GB/T 23228—2008规定的色谱条件，具体如下：

程序升温：初始温度150℃，保持2 min；以3℃/min速率升至230℃，20℃/min速率升至260℃，保持20 min；进样口温度：230℃；载气：氦气，恒流10 mL/min进样量：2 μL，不分流，不分流时间：1 min，吹扫流量：50 mL/min；热裂解温度：550℃；接口温度：250℃。

标样和卷烟烟气样品色谱图见图2。

图2 标样 (a)和卷烟烟气样品(b)色谱图Fig.2 Chromatogram of standard solution sample (a) and mainstream cigarette smoke sample (b)

2 结果与讨论

2.1 方法原理

用GC-TEA法测定卷烟主流烟气中的TSNAs，样品前处理分为样品提取、浓缩、净化、再浓缩四步；具体操作步骤为：捕集了卷烟主流烟气总粒相物的滤片用二氯甲烷提取，提取液进行浓缩，浓缩液加到氧化铝层析柱上，用二氯甲烷-甲醇为洗脱剂洗脱净化，柱层析净化后的流出液再浓缩，然后供仪器分析用。而采用本文中的装置，启动水浴锅加热，溶剂蒸发后再经回流冷凝管(图1中1)冷凝回到提取器中；溶剂经无水硫酸钠层(图1中14)干燥，然后再把剑桥滤片(图1中13)上捕集的TSNAs洗脱下来；经过下面的碱性氧化铝柱(图1中12)净化，这样杂质保留在碱性氧化铝柱上，而TSNAs则被溶剂洗脱下而进入圆底烧瓶中，经过一段时间的回流提取，样品中的TSNAs被完全提取，转换三通阀，让溶剂从溶剂回收出口流出，这样圆底烧瓶中的溶液不断被浓缩，当浓缩到约1 mL时停止加热，取出样品，即可供分析用。

2.2 萃取、净化溶剂的选择

TSNAs测定样品前处理的关键步骤是氧化铝柱层析净化，溶剂的选择非常重要，溶剂对氧化铝柱的洗脱强度适当才能让TSNAs从氧化铝柱上洗脱，并让杂质更多的保留在柱上，从而达到样品净化的目的。传统方法一般用一种洗脱强度小的溶剂(二氯甲烷)和一种洗脱强度大的溶剂(甲醇)混合作为洗脱剂，通过两者的比例调节洗脱强度。在本方法中，要求两种溶剂的沸点相近，以保持在水浴加热时能达到基本同时气化。氯仿的沸点(61.3℃)和丙酮的沸点(56.5℃)非常接近，经常使用这两种溶剂混合调节溶剂强度作为正相色谱的流动相，因此选择氯仿和丙酮混合作为本实验中的提取、净化溶剂。试验了不同比例的氯仿和丙酮混合对烤烟型、混合型卷烟烟气样品中TSNAs的萃取效率的影响，见图3、图4，结果表明：丙酮的比例过低会导致柱上的亚硝胺洗脱不完全，使测定结果偏低，丙酮的比例过高又会导致大量杂质洗脱而达不到预期的净化效果；丙酮和氯仿的比例在20:80时能将样品中的TSNAs完全萃取，且能达到较好净化效果，因此，本实验中选择体积比为2:8的丙酮-氯仿作为前处理中的溶剂。

图3 萃取溶剂体积比对烤烟型卷烟主流烟气中TSNAs萃取效果的影响Fig.3 Effect of volume ratio of extraction solvent on determina tion of TSNAs in flue-cured cigarette smoke

图4 萃取溶剂体积比对混合型卷烟主流烟气中TSNAs萃取效果的影响Fig.4 Effect of volume ratio of extraction solvent on determina tion of TSNAs in blended cigarette smoke

2.3 萃取剂体积的选择

在本实验中，需在提取装置中加入足够量的溶剂，以保持溶剂在前处理过程中能循环，实验表明，当提取装置中的溶剂量达120 mL时能保持正常循环，但考虑到在样品前处理过程中溶剂因蒸发而有少量损失，因此选择在提取器中加入150 mL的氯仿-丙酮混合溶剂。

2.4 水浴温度的选择

在本实验中，氯仿的沸点为61.3℃，丙酮的沸点为56.5℃，当水浴温度超过70℃时，尾管烧瓶中的溶剂开始沸腾，随温度增加，溶剂蒸发速度迅速加快，当温度达到75℃时溶剂蒸发速度能达到10 mL/min左右（稍大于氧化铝柱上的流下速度），温度过高则会增加提取过程中的溶剂损失，因此，实验选择水浴温度为75℃。

2.5 萃取时间的选择

选取烤烟型、混合型卷烟样品各一个，采用RM200 转盘式吸烟机进行抽吸后将捕集有TSNAs的剑桥滤片在75℃的水浴中进行回流提取，考察提取时间对TSNAs测定结果的影响。比较了提取时间分别为20、25、30、35、40、45、50 min的测定结果，如图5、图6所示。结果表明：萃取时间为20 min时，由于样品萃取不完全导致结果偏低，40 min以后萃取效率达到一个稳定值，为节约时间并避免引入更多的干扰成分，因此，选择40 min 作为提取含有TSNAs的剑桥滤片的最佳时间。

图5 萃取时间对烤烟型卷烟流烟气TSNAs测定结果的影响Fig.5 Effect of extraction time on determination of TSNAs in fl uecured type cigarette smoke

图6 萃取时间对混合型卷烟流烟气TSNAs测定结果的影响Fig.6 Effect of extraction time on determination of TSNAs in blended cigarette smoke

2.6 定量校正曲线及方法的检测限

6级校正溶液分析后，建立了内标法校正曲线。在10～4000 ng/mL 的范围内，4种TSNAs的线性相关系数均大于0.999，表明本方法拥有较宽的、良好的线性范围。上述浓度范围相当于每支卷烟主流烟气中NNN、NNK、NAT、NAB含量为0.5～200 ng/cig，覆盖的样品含量范围广，基本可以满足所有卷烟样品的分析测定。

将最低浓度的标准溶液连续进样10次，测定其标准偏差，以3倍标准偏差作为检出限，以10倍标准偏差作为定量限。具体结果见表1。

表1 本方法的线性范围、相关系数及检测限Tab.1 Linear range,correlation coefficients,and LOQ

2.7 方法的精密度和回收率

选取烤烟型、混合型卷烟样品各一个，进行5次日内和日间平行性测定，如表2所示。结果表明，4种TSNAs日内、日间测定结果的相对标准偏差分别在3.06%～5.80% 和 3.40%～6.93% 之间，说明本方法的重复性较好。

表2 方法的重复性结果Tab.2 Results from repeatability test ng/cig

选取烤烟型、混合型卷烟各一个样品，以其实际含量的约20%、50%、100%加入标准物质，测定本方法的样品加标回收率，结果列于表3。烤烟型卷烟主流烟气中4种TSNAs的回收率在92.0%～102.0%之间，混合型卷烟主流烟气中4种TSNAs回收率在93.8～102.3%之间，说明本方法的样品加标回收率良好。

表3 本方法的回收率试验结果Tab.3 Recovery rate

续表3

2.8 本方法和 CORESTA方法的对比

将本方法的前处理时间和溶剂消耗量与CORESTA N° 63方法进行对比，结果见表4，从表中可以看出采用本方法明显缩短了前处理的时间，提高了工作效率，减少了前处理过程中有机溶剂用量，且精密度高于CORESTA N° 63方法，主要是由于改良的索氏提取器将传统方法中的提取、浓缩、柱层析净化、再浓缩四步有机结合起来，有效减少了分析误差，提高了方法的精密度。

表4 本方法和 CORESTA N° 63方法的比较结果Tab.4 Comparison with CORESTA N° 63 method

3 实际样品的测定及与CORESTA方法的比对

3.1 参比卷烟主流烟气中 TSNAs的测定

采用本方法测定了1R5F和2R4F卷烟主流烟气中TSNAs的释放量，并与2006年CORESTA组织的17家实验室共同实验数据平均值进行了比较，结果见表5。由表5可知，采用本方法的测定结果与CORESTA共同实验结果具有较好的一致性。

表5 参比卷烟主流烟气中的TSNAs检测结果比较Tab.5 Comparison of TSNAs in reference cigarettes mainstream smoke ng/cig

3.2 卷烟主流烟气中 TSNAs的测定

采用本方法和CORESTA N° 63方法测定了国内市场销售的15个卷烟样品主流烟气中TSNAs的释放量，将各样品含量进行比较。由表6可以看出，采用本方法对样品进行测定的结果与CORESTA方法的测定结果进行成对t检验，4种TSNAs的t检验值均大于0.05，表明两种方法的测定结果无显著性差异。

表6 本方法及 CORESTA N° 63方法测定国内卷烟主流烟气中TSNAs的结果比较Tab.6 Comparison of TSNAs in domestic cigarette smoke detect ed by this method and by CORESTA N° 63 method ng/cig

4 结论

本研究依托改良的索氏提取器对GC-TEA法测定卷烟主流烟气TSNAs的前处理方法进行改进。采用改良的索氏提取器可将原方法中的提取、浓缩、柱层析净化、再浓缩四步有机结合，避免了样品前处理过程中的多次转移、浓缩，简化了操作步骤，可有效减少分析误差，使测定结果更加准确，而且样品处理在相对封闭的装置中完成，避免了GB/T 23228—2008（或CORESTA N° 63）前处理方法中许多敞开操作，减少了环境污染。采用本方法在10～4000 ng/mL的浓度范围内，4种TSNAs的线性相关系数均大于0.999，检测限在0.12～0.15 ng/cig之间，回收率在92.0%～102.3% 之间，日内相对标准偏差在3.06%～ 5.80% 之间，日间相对标准偏差在3.40%～6.93%之间，说明本方法的回收率高，重复性好；且本方法的测定结果与CORESTA N° 63方法进行了配对t检验，结果无显著性差异，说明本方法准确可靠，适用于主流烟气中TSNAs的分析检测。

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Improvement of pretreatment method for determination of TSNAs in mainstream cigarette smoke by GC-TEA

ZHANG Xia,ZHU Donglai,HAN Yi,LEI Ping,YANG Guangyu,GONG Xi aowei,LI Shoubo,DUAN Yuanxing,HAN Jingmei,CHEN Yongkuan
Non-traditional Tobacco Products Institute,Technology Center,China Tobacco Yunnan Industrial CO.,Ltd,Kunming 650231,China

In order to improve pretreatment method for the determination of TSNAs in mainstream cigarette smoke by GC-TEA，improved soxhlet extractor was used to pre-treat mainstream cigarette smoke samples which combined four steps of extraction,concentration,column chromatography pufication and re-concentration traditionally used.Results indicated that: 1) with concentration range of 10-4000 ng/mL,the linear correlation coefficients of four TSNAs regression curves were higher than 0.999.The limits of quantification of this method ranged from 0.12 to 0.15 ng/cig,the recoveries were from 92.0% to 102.3% ,the intra-day relative standard deviations(RSD) were between 3.06% and 5.80%,and the inter-day RSD were between 3.40% and 6.93%.2) No significant difference was detected compared with CORESTA N° 63 method.Repeated transferring and concentrating steps could be avoided.Therefore this method was suitable for the determination of TSNAs in mainstream cigarette smoke as it featured more accuracy and better reliability as well as simplified operation steps,shorted pretreatment time,less organic solvents,reduced analysis errors.

improved soxhlet extractor;GC-TEA;mainstream cigarette smoke;tobacco-specific N-nitrosamines

张霞，朱东来，韩熠,等.GC-TEA法测定卷烟主流烟气TSNAs前处理方法的改进[J].中国烟草学报，2015,21（3）

云南中烟新型烟草制品研发及其共性技术研究（2014CP02）

张霞（1984—），硕士，助理研究员，主要从事新型烟草制品研究，Email：zhangxia840511@163.com

陈永宽（1966—），博士，研究员，主要从事新型烟草制品研究，Email:cyk1966@163.com

2014-04-25

: ZHANG Xia,ZHU Donglai,HAN Yi,et al.Improvement of pretreatment method for determination of TSNAs in mainstream cigarette smoke by GC-TEA [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)