受体相互作用蛋白1在颅脑创伤后神经细胞坏死性凋亡过程中的作用

刘小伟，陈以胜(综述)，程世翔，涂 悦※(审校)

(1.天津中医药大学研究生院，天津 300193； 2.天津市神经创伤修复重点实验室 武装警察部队脑创伤与神经疾病研究所武装警察部队后勤学院附属医院脑科医院，天津 300162)



受体相互作用蛋白1在颅脑创伤后神经细胞坏死性凋亡过程中的作用

刘小伟1,2△，陈以胜2△(综述)，程世翔2，涂 悦2※(审校)

(1.天津中医药大学研究生院，天津 300193； 2.天津市神经创伤修复重点实验室 武装警察部队脑创伤与神经疾病研究所武装警察部队后勤学院附属医院脑科医院，天津 300162)

颅脑创伤可引起多种类型的细胞发生改变，包括神经元、神经胶质细胞和其他支持细胞等，其中神经元死亡是引起神经系统退化和致死的一个主要原因，因此其机制也是近些年的研究热点。以往研究资料显示，受体相互作用蛋白(RIP)家族在介导细胞死亡过程中发挥着关键作用，尤其是RIP1在多种形式的细胞死亡过程中均扮演重要角色，包括近几年研究新发现的坏死性凋亡，即一种不依赖含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的程序性细胞死亡类型。

颅脑创伤；坏死性凋亡；受体反应蛋白1

神经细胞死亡是中枢神经系统发展中的重要组成部分，也是在颅脑创伤的病理条件下清除不良细胞所必要的，然而过度的神经细胞损失将可能引起急、慢性神经退行性疾病。颅脑创伤的发病机制的基础研究虽取得一些进展，但大部分颅脑创伤患者在经过一定临床治疗后仍遗留不同程度的认知、行为和交流障碍[1]。受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)和RIP3由于特殊的细胞信号转导机制和病理学性质，一直以来研究较为广泛。2000年Holler等[2]在应用FasL、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)及TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)诱导细胞坏死时，发现RIP1是细胞坏死的关键调节分子，RIP1的化学抑制剂necrostatin出现后，坏死的研究取得突破性进展，并逐渐明确程序性坏死这一细胞死亡类型。RIP3是Cho等[3]在2009年发现的受体反应蛋白家族的另一成员，并也被证实是细胞死亡受体信号转导通路中的重要信号分子，参与到细胞的坏死性凋亡过程。RIP1和RIP3两种蛋白在多种细胞死亡通路中同时出现。现就RIP1在颅脑创伤后神经细胞坏死性凋亡过程中的作用。

1 RIP1的结构与功能

RIP1在死亡受体信号转导过程中发挥着多重作用，既涉及介导核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的活性调节从而促进细胞生存，也涉及介导细胞的凋亡和坏死性凋亡过程[4]。RIP1是一类丝/苏氨酸激酶，包括3个主要的结构域，分别为N端激酶结构域、中间结构域和C端的能与肿瘤坏死因子受体相关死亡区域(TNF receptor associated death domain，TRADD)相结合的结构域，其中N端的丝/苏氨酸结构域对于坏死性凋亡过程不可或缺，但在激活NF-κB和细胞凋亡过程中并非必需[2]。当凋亡路径被阻断时，RIP1和坏死性凋亡由死亡受体的配体(如TNF-α、Fas等)激活[5]。necrostatin-1(Nec-1)作为坏死性凋亡的抑制剂，同时也是RIP1的有效抑制剂。Ortolano等[6]发现，RIP1抑制剂可减少控制性皮质损伤大鼠的神经细胞死亡并增强运动和认知功能，由此推测RIP1在颅脑创伤后神经细胞坏死性凋亡过程中具有重要作用。Degterev和Yuan[4]研究证实，RIP1作为其主要上游信号也参与到坏死性凋亡这一过程。由此可见，RIP1是细胞死亡程序中的重要靶点。

2 RIP1介导细胞坏死性凋亡的机制

TNF-α是最普遍应用于研究坏死性凋亡的因子，TNF受体1(TNF receptor 1，TNFR1)则作为主要的受体参与其中[7]，RIP1在坏死性凋亡信号转导过程中的作用是与凋亡和NF-κB 的活化机制联系在一起的。对于许多类型细胞，TNF-α刺激并不引起凋亡和坏死性凋亡，除非NF-κB信号被阻断[8]。当胞膜上的TNFR被激活后，RIP1信号将导致细胞产生不同的后果。

细胞凋亡的途径主要分细胞外的死亡受体途径和细胞内的线粒体途径两种类型，其中后者是各种刺激因素通过影响细胞内线粒体膜电位，从而使胞内Ca2+浓度升高，pH值下降，进一步激活胱天蛋白酶(caspase)9，并通过一系列信号转导，引起细胞凋亡；RIP1主要是参与前者中发挥作用，在细胞外的死亡受体途径中，由TNFR家族介导，经过一系列信号转导，激活caspase-8，并最终引起细胞凋亡[8]。TNF-α与TNFR1 结合后，引起TNFR1的结构发生改变，在细胞内装配形成TNFR复合体Ⅰ，该复合体包括以下几个组分：TRADD、RIP1、TNFR相关因子2(TNFR-associated factor 2，TRAF2)以及TRAF5。TNFR复合体Ⅰ形成后，TNFR1从复合体上解离，此时细胞质中的RIP3与复合体中的RIP1相结合，Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)通过内吞作用进入细胞与TRADD结合，最终形成TNFR复合体Ⅱ(即TRADD-FADD-RIP1-RIP3组合体)[9]。FADD继而募集caspase-8并进行自我活化，启动经典的外源性细胞凋亡途径。凋亡途径启动的同时，caspase-8发生裂解，导致RIP1和RIP3失活，从而阻断坏死性凋亡通路[9-10]。由此可见，在一般情况下，死亡受体的激活将诱导细胞发生凋亡，而只有当caspase-8功能被阻断时，细胞才将启动坏死性凋亡。坏死性凋亡与凋亡具有部分共同的通路，只是从形成TNFR复合体Ⅱ 之后，凋亡途径需要依赖caspase的参与，而坏死性凋亡则需要抑制caspase的活性。当凋亡途径被凋亡抑制剂(如细胞凋亡抑制因子cIAP1、cIAP2或E3泛素连接酶)阻断时，TNFR的配体(如TNF-α、Fas)激活RIP1，经一系列信号转导，最后由caspase活性抑制剂zVAD激活坏死性凋亡。RIP1如何被激活并启动由caspase抑制物引起的坏死性凋亡尚不明确，但可推定RIP1被凋亡抑制物泛素化，泛素化状态可调节RIP1的活性[11]。caspase-8一旦被药物或者RNA干扰等因素所阻断，RIP1和RIP3便可被某种激酶磷酸化，继续启动不依赖caspase参与的坏死性凋亡。磷酸化后的RIP1和RIP3发生构象，两者相互结合得更加紧密，使TNFR复合体Ⅱ的稳定性大大增强，与此同时RIP3被激活，继续启动下游信号通路。RIP1和RIP3的结合与磷酸化是坏死性凋亡的关键性和特异性步骤，是坏死性凋亡发生的标志[12]。但也有研究认为，TNF可以在缺乏RIP1的情况下激活RIP3，最终引发坏死性凋亡[13]。

TNFR复合体Ⅰ中的TNFR相关因子2可继续结合凋亡蛋白细胞抑制物，该抑制物可介导Lys63发生泛素化，在泛素化的过程中，RIP1充当脚手架蛋白的角色，可使转化生长因子B激活激酶1(transforming growth factor-B activated kinase 1，TAK1)、TAK结合蛋白2(TAK1-binding protein 2，TAB2)和TAB3在此基础上相互结合，从而形成TAK1-TAB2-TAB3复合物，最终激活NF-κB[10]。而对于NF-κB激活的调节也比较特殊，包括正反馈调节和负反馈调节两个方面。NF-κB的激活可以引起细胞内某些因子的表达量增加，比如肿瘤坏死因子和白细胞介素1等，这些因子的表达增加又可反过来激活NF-κB[14]，最终都对细胞死亡有一定的增强和促进作用。

3 颅脑创伤与坏死性凋亡

从一般概念上讲，颅脑创伤后的神经细胞死亡根据其特点可分为原发性死亡和继发性死亡。前者指细胞膜瓦解所致的细胞直接死亡；后者反映的是受伤部位周围和远离受伤区域的细胞迟发性或继发性死亡，是由于创伤引起细胞发生生理或生化改变而导致的[15]。目前对中枢神经系统的细胞死亡研究仍具有一定的挑战性，因为即使在超微结构水平，对死亡神经细胞的描述与人体内其他组织死亡细胞也不尽相同。如Oney等[16]运用超微技术研究发现了大脑内的两种神经细胞死亡方式：生理性细胞死亡和兴奋毒性细胞死亡，前者类似于细胞凋亡，而后者类似于细胞胀亡，都与人体其他组织的细胞死亡有一定差异。

过去一般将颅脑创伤后神经细胞的死亡方式归为两类：坏死和凋亡。坏死是一种细胞被动死亡，通常伴随着离子平衡和胞膜完整性的破坏，以及器官和细胞的肿胀。而凋亡是一种需要消耗能量的细胞主动死亡过程，通常伴随着细胞质和细胞核的浓缩、细胞体积变小，但保持相关器官结构的完整性[1]。这种命名方式当然有其局限性，因为坏死的形态和凋亡的机制可同时联系在一起[17]。实际上坏死和凋亡这两种细胞死亡类型经常同时存在，中间形态也被鉴别出来，最初有人提出aponecnosis这一新词[18]，即坏死性凋亡这一新型细胞死亡模式，Degterev等[5]深入研究并首次报道，命名其为necroptosis。

颅脑创伤后不论是出血性还是缺血性损伤，引起神经细胞死亡的根本原因都是脑缺血，所有保护神经策略的核心就是防止缺血性(继发性)损伤[19]。缺血性损伤通常会引起凋亡，但近年来的研究表明坏死性凋亡也是缺血性脑损伤的重要机制之一[20]。随着研究的进展，程序性死亡逐渐被证实是颅脑创伤后神经细胞死亡并导致患者预后不良的主要原因[21]。过去对程序性死亡的认识仅局限于凋亡，随着细胞生物学研究的深入，新形式的细胞死亡途径逐渐被揭示，如胀亡、自噬、副凋亡等，各种机制相互交联，并有彼此重叠的机制出现。然而坏死性凋亡作为研究的重点，仍存在着许多未知。

导致细胞发生坏死性凋亡的因素很多，包括诸如肿瘤坏死家族(如TNF-α)、Fas等配体，物理或化学性损伤，低氧状态等[22]，其中以TNF-α研究最为普遍。颅脑创伤后，缺血缺氧、感染和兴奋毒性作用被认为是诱发坏死性凋亡的主要因素，这些因素进一步发生连锁式的反应，如产生活性氧类(reactive oxygen species，ROS)，释放兴奋性氨基酸、促炎细胞因子(如IL-1γ、IL-18、TNF-α)[23]、趋化因子、TNF(如TNF-α、TNF-β、FasL、TRAIL、TWEAK)[24]，通过一系列的信号转导最终引起凋亡或坏死性凋亡的发生。许多证据表明，Redox对调控坏死性凋亡发挥着重要作用，Vanlangenakker等[25]研究发现，在坏死性凋亡早期阶段ROS的量急剧增高，而抑制ROS的产生则可以减少坏死性凋亡。诱发坏死性凋亡大都要涉及RIP1这一中间因子，RIP1不仅调控坏死性凋亡中TNFR1 的下游信号，而且对TNF-α的产生也有一定作用，在一定条件下，RIP1可促使TNF-α释放增多，从而又反过来促进细胞坏死性凋亡的进行[12]。

4 对颅脑创伤后坏死性凋亡的干预

TNF诱导的细胞坏死性凋亡以及RARP通路，展现了坏死性凋亡的两种独特途径，病理状态下的坏死性凋亡的重要性也越来越明显[26]。Linkermann等[27]发现通过靶向抑制RIP1可大大降低实验大鼠的肾脏、视网膜和心脏的缺血再灌注损伤，抑制颅脑创伤的恶化，并能增强其运动及认知功能。Krishnakumar和Kraus[28]研究发现，通过抑制PARP-1，也可有效治疗脑卒中及心肌缺血等疾病，对1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎等自身免疫性疾病也有很大的治疗前景。

Nec-1作为目前应用最为广泛的坏死性凋亡抑制剂，与坏死性凋亡信号转导过程中的特异性分子RIP1-RIP3成为研究坏死性凋亡的重要手段，包括对颅脑创伤后的神经细胞死亡进行研究，并揭示了许多类型的细胞坏死实际上是坏死性凋亡，如谷氨酸诱导的海马神经元坏死[29]、心肌缺血性损伤[30]等。此外，目前还有其他一些坏死性凋亡的抑制剂，如乙内酰脲、三环衍生物等[31]，这些基本都是在实验的背景下应用。

5 展 望

颅脑创伤后的继发性脑损害非常重要，除了涉及细胞坏死外，还包括坏死性凋亡，后者由于是程序性细胞死亡，在一定条件下可以逆转，临床医师可以把握这一时期的治疗，尽可能降低神经细胞的坏死凋亡，改善患者病情和生存质量。过去对于RIP1和RIP3的研究已经取得一定成果，并解释了关于细胞死亡的一些相关机制，但并未形成有效的应用于临床上的具体治疗方法。RIP1作为介导坏死性凋亡的关键因子，可以对其靶向抑制，以干扰坏死性凋亡的信号传递路径，从而验证各种干预措施对坏死性凋亡的效果，并制订临床上针对颅脑创伤的治疗措施。

[1] Veenith T,Goon SSh,Burnstein RM,etal.Molecular mechanisms of traumatic brain injury:the missing link in management[J].World J Emerg Surg,2009,4(1):7.

[2] Holler N,Zaru R,Micheau O,etal.Fas triggers an alternative,caspase-8-independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule[J].Nat Immunol,2000,1(6):489-495.

[3] Cho YS,Challa S,Moquin D,etal.Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation[J].Cell,2009,137(6):1112-1123.

[4] Christofferson DE,Yuan J.Necroptosis as an alternative form of programmed cell death[J].Curr Opin Cell Biol,2010,22(2):263-268.

[5] Degterev A,Huang Z,Boyce M,etal.Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury[J].Nat Chem Biol,2005,1(2):112-119.

[6] Ortolano F,Colombo A,Zanier ER,etal.c-Jun N-terminal kinase pathway activation in human and experimental cerebral contusion[J].J Neuropathol Exp Neurol,2009,68(9):964-971.

[7] Stoica BA,Faden AI.Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury[J].Neurotherapeutics,2010,7(1):3-12.

[8] Oeckinghaus A,Hayden MS,Ghosh S.Crosstalk in NF-κB signaling pathways[J].Nat Immunol,2011,12(8):695-708.

[9] Kreuz S,Siegmund D,Scheurich P,etal.NF-kappaB inducers upregulate cFLIP,a cycloheximide-sensitive inhibitor of death receptor signaling[J].Mol Cell Biol,2001,21(12):3964-3973.

[10] Micheau O,Tschopp J.Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes[J].Cell,2003,114(2):181-190.

[11] 陈牧,黄雷.Necroptosis信号通路与靶向治疗的研究进展[J].生命科学,2012,24(7):666-673.

[12] Christofferson DE,Li Y,Hitomi J,etal.A novel role for RIP1 kinase in mediating TNFα production[J].Cell Death Dis,2012,3:e320.

[13] Ye YC,Yu L,Wang HJ,etal.TNFα-induced necroptosis and autophagy via supression of the p38-NF-κB survival pathway in L929 cells[J].J Pharmacol Sci,2011,117(3):160-169.

[14] Moujalled DM,Cook WD,Okamoto T,etal.TNF can activate RIPK3 and cause programmed necrosis in the absence of RIPK1[J].Cell Death Dis,2013,4:e465.

[15] Kulms D,Schwarz T.NF-kappaB and cytokines[J].Vitam Horm,2006,74:283-300.

[16] Dikranian K,Ishimaru MJ,Tenkova T,etal.Apoptosis in the in vivo mammalian forebrain[J].Neurobiol Dis,2001,8(3):359-

379.

[17] Yu SW,Andrabi SA,Wang H,etal.Apoptosis-inducing factor mediates poly (ADP-ribose) (PAR) polymer-induced cell death[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(48):18314-18319.

[18] Formigli L,Papucci L,Tani A,etal.Aponecrosis:morphological and biochemical exploration of a syncretic process of cell death sharing apoptosis and necrosis[J].J Cell Physiol,2000,182(1):41-49.

[19] Polderman KH.Induced hypothermia and fever control for prevention and treatment of neurological injuries[J].Lancet,2008,371(9628):1955-1969.

[20] You Z,Savitz SI,Yang J,etal.Necrostatin-1 reduces histopathology and improves functional outcome after controlled cortical impact in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2008,28(9):1564-1573.

[21] Minambres E,Ballesteros MA,Mayorga M,etal.Cerebral apoptosis in severe traumatic brain injury patients:an in vitro,in vivo,and postmortem study[J].J Neurotrauma,2008,25(6):581-591.

[22] Vandenabeele P,Galluzzi L,Vanden Berghe T,etal.Molecular mechanisms of necroptosis:an ordered cellular explosion[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(10):700-714.

[23] Hagberg H,Mallard C.Effect of inflammation on central nervous system development and vulnerability[J].Curr Opin Neurol,2005,18(2):117-123.

[24] Taylor DL,Jones F,Kubota ES,etal.Stimulation of microglial metabotropic glutamate receptor mGlu2 triggers tumor necrosis factor alpha-induced neurotoxicity in concert with microglial-derived Fas ligand[J].J Neurosci,2005,25(11):2952-2964.

[25] Vanlangenakker N,Vanden Berghe T,Bogaert P,etal.cIAP1 and TAK1 protect cells from TNF-induced necrosis by preventing RIP1/RIP3-dependent reactive oxygen species production[J].Cell Death Differ,2011,18(4):656-665.

[26] Sosna J,Voigt S,Mathieu S,etal.TNF-induced necroptosis and PARP-1-mediated necrosis represent distinct routes to programmed necrotic cell death[J].Cell Mol Life Sci,2014,71(2):331-348.

[27] Linkermann A,Bräsen JH,Himmerkus N,etal.Rip1 (receptor-interacting protein kinase 1) mediates necroptosis and contributes to renal ischemia/reperfusion injury[J].Kidney Int,2012,81(8):751-761.

[28] Krishnakumar R,Kraus WL.The PARP side of the nucleus:molecular actions,physiological outcomes,and clinical targets[J].Mol Cell,2010,39(1):8-24.

[29] Xu X,Chua CC,Kong J,etal.Necrostatin-1 protects against glutamate-induced glutathione depletion and caspase-independent cell death in HT-22 cells[J].J Neurochem,2007,103(5):2004-2014.

[30] Smith CC,Yellon DM.Necroptosis,necrostatins and tissue injury[J].Cell Mol Med,2011,15(9):1797-1806.

[31] Teng X,Keys H,Yuan J,etal.Structure-activity relationship and liver microsome stability studies of pyrrole necroptosis inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett,2008,18(11):3219-3223.

The Role of Receptor-interacting Protein-1 in Neuronal Cell Necroptosis after Traumatic Brain Injury

LIUXiao-wei1,2,CHENYi-sheng2,CHENGShi-xiang2,TUYue2.

(1.GraduateSchoolofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China; 2.TianjinKeyLaboratoryofNeurotraumaRepair,InstituteofTraumaticBrainInjuryandNeuroscienceofChineseArmedPoliceForces,Neurology&NeurosurgeryHospitalofAffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChineseArmedPoliceForces,Tianjin300162,China)

Traumatic brain injury may induce changes in multiple cell types, such as neurons,gliocytes,astricytos,and other supporting cells.However,neuron death is a major cause of the degeneration of the central nervous system,as well as death.The mechanisms of neuronal cell death have been the predominant focus.Data demonstrate that receptor-interacting protein-1 plays a key role in mediating cell death processes, and is critically involved in mediating necroptosis, a Caspase-independent pathway of programmed cell death highlighted in recent years.

Traumatic brain injury; Necroptosis; Receptor-interacting protein-1

国家自然科学基金(31200809)；武警后勤学院科研创新团队(WHTD201306)

R329. 2

A

1006-2084(2015)12-2145-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.012

2014-08-25

2014-11-25 编辑：相丹峰