响应面法优化苏氨酸铬合成工艺

胡晓波，王光然，姜雯雯，龚 毅，谢明勇*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

响应面法优化苏氨酸铬合成工艺

胡晓波，王光然，姜雯雯，龚 毅，谢明勇*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

以苏氨酸和氯化铬为原料，在水溶液中反应合成了新型铬营养强化剂——苏氨酸铬。在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken试验设计原理，选择四因素三水平，利用响应面法优化苏氨酸铬的合成工艺条件，确定其最佳工艺条件为苏氨酸与氯化铬物质的量比3.86∶1、反应体系pH 6.11、反应温度93.52 ℃、反应时间3.25 h，在此条件下苏氨酸铬产率为68.73%。实测值与回归模型预测值（68.82%）相对误差为0.13%，说明采用响应面法优化得到的合成条件可靠。

苏氨酸铬；合成；响应面法

铬是人体必需的一种微量元素，参与机体糖、脂肪、蛋白质的代谢，与人体健康有着非常密切的关系[1]。如果人体缺铬，将导致糖尿病和其他相关疾病[2-3]。补铬对治疗Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病及类固醇引起的糖尿病等都有很好的疗效[4-5]。Ravina等[6]的研究表明，铬对Ⅰ型糖尿病以及类固醇引起的糖尿病均有很好疗效；另有研究[7-8]发现，铬能缓解Ⅱ型糖尿病患者的胰岛素抵抗；Jovanovic等[9]则提出对于妊娠糖尿病妇女，补铬可以作为一种辅助治疗手段。铬在降低畜禽应激、提高免疫力、改善繁殖性能、提高胴体品质、促进生长等方面均有作用[10-11]。

苏氨酸铬分子式为Cr(C4H8O3N)3，它是由3分子苏氨酸与1分子铬形成的螯合物[12-13]。前期实验结果表明苏氨酸铬属于实际无毒级别物质，具有一定的降低血糖的作用[14-15]。同时苏氨酸铬作为新饲料添加剂在动物养殖的实践，表明其能有效促进动物生长、增强动物抵抗力，提高饲料利用效率[12]。因此，苏氨酸铬作为一种新型的营养强化剂将具有广阔的应用与开发前景。

响应面法是一种多元分析方法，已经广泛应用于食品、化工等领域的工艺条件优化研究[16-20]，本实验采用苏氨酸和氯化铬为原料合成苏氨酸铬，通过响应面法[21]多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系研究各影响因素之间的交互作用，考察苏氨酸铬合成最佳反应条件，为营养强化剂苏氨酸铬的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化铬、氢氧化钠 天津大茂化学试剂厂；L-苏氨酸 上海劲马生物科技有限公司。试剂除特别注明外均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水处理系统 美国Millipore公司；HH-4型恒温水浴锅、JJ-1型精密增力电动搅拌器 常州国华电器有限公司；DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；DZG-6050型真空干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；FiveEasy 20型精密pH计（带Inlab Routine Pro电极） 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 苏氨酸铬的制备[12-13]

苏氨酸和氯化铬按适当比例溶解于超纯水中，在一定温度的水浴中加热搅拌反应。反应过程中用NaOH溶液调节反应液到相应的pH值后，再反应相应的时间。反应结束后，将反应液置于室温条件下冷却结晶后抽滤，滤饼用大量超纯水反复洗涤，抽干后，放入真空干燥箱中，于55 ℃、—0.95 MPa条件下干燥至质量恒定，称质量后粉碎得到产品。

1.3.2 苏氨酸铬合成的单因素试验

根据文献[22-23]报道，反应体系pH值、苏氨酸与氯化铬物质的量比、反应温度以及反应时间都可能会对苏氨酸铬产率（以其实际产量与理论产量之比计算）产生影响。因此，进行单因素试验，考察这几个因素对苏氨酸铬产率的影响。在固定苏氨酸与氯化铬物质的量比3∶1、反应温度70 ℃、反应时间1 h条件下，反应体系pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；在固定反应体系pH 6.0、反应温度70 ℃、反应时间1 h条件下，苏氨酸与氯化铬物质的量比分别为1∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1；在固定反应体系pH 6.0、苏氨酸与氯化铬物质的量比3.5∶1、反应时间1 h条件下，反应温度分别为50、60、70、80、90、100 ℃；在固定反应体系pH 6.0、苏氨酸与氯化铬物质的量比3.5∶1、反应温度90 ℃条件下，反应时间分别为0.5、1、2、3、4、5 h。

1.3.3 响应面法优化苏氨酸铬合成工艺条件

为了分析各因素之间的交互作用对结果的影响，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计，以苏氨酸铬产率（Y）为考察指标，分别以反应体系pH值、苏氨酸与氯化铬物质的量比、反应温度以及反应时间对应4 个独立变量X1、X2、X3和X4[24]，确定最佳的合成工艺条件，试验的因素水平编码见表1。

表 1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 反应体系pH值对苏氨酸铬产率的影响

图 1 反应体系pH值对苏氨酸铬产率的影响Fig.1 Effect of pH on the yield of chromium threoninate

图1 表明，反应体系pH值对苏氨酸铬产率有极大的影响。pH值较低时，苏氨酸质子化，难以和铬离子发生螯合反应生成苏氨酸铬，因此pH值小于4时，不能生成苏氨酸铬；当调整反应体系pH值为5.0～7.0时，苏氨酸呈两性离子形式，通过加碱中和苏氨酸上的酸质子，有利螯合反应进行，反应过程中有桃红色沉淀（苏氨酸铬）生成，在pH 6.0左右时，苏氨酸铬产率最高；而当反应体系pH值大于7时，溶液中OH—更易于与铬离子发生反应生成带有灰绿色的Cr(OH)3沉淀[23]。所以苏氨酸铬产率又呈现下降的趋势。因此将反应体系pH值的考察范围定为5.0～7.0。

2.1.2 苏氨酸与氯化铬物质的量比对苏氨酸铬产率的影响

图 2 苏氨酸与氯化铬物质的量比对苏氨酸铬产率的影响Fig.2 Effect of molar ratio between threonine and chromium chloride on the yield of chromium threoninate

由图2可知，在苏氨酸与氯化铬物质的量比2∶1～3.5∶1范围内，随着苏氨酸物质的量比的增加，苏氨酸铬产率不断增加，这是由于铬离子的配体数随着物质的量比的增加而增加，当苏氨酸过量时可使反应进行得更加完全，产率得以提高，但当物质的量比达到3.5∶1后，产率提高缓慢。综合考虑反应产率及经济因素，苏氨酸与氯化铬的最佳物质的量比为3.5∶1。因此，响应面试验中苏氨酸与氯化铬物质的量比考察范围定为3∶1～4∶1。

2.1.3 反应温度对苏氨酸铬产率的影响

图 3 反应温度对苏氨酸铬产率的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on the yield of chromium threoninate

从图3可以看出，随着反应温度的升高，苏氨酸铬产率不断增加，高于90 ℃后，产率变化不大，因此将反应温度的考察范围定为80～100 ℃。

2.1.4 反应时间对苏氨酸铬产率的影响

图 4 反应时间对苏氨酸铬产率的影响Fig.4 Effect of reaction time on the yield of chromium threoninate

图4 表明，随着反应时间的延长，苏氨酸铬产率不断增加，当反应时间达到3 h后，产率增加缓慢，所以将反应时间的考察范围定为2～4 h。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 回归模型的建立及数据分析结果

采用四因素三水平的Box-Behnken试验设计，综合单因素试验结果，确定最终试验方案，共27 个试验点。其中试验号1～24为析因试验，试验号25～27为中心试验，这27 个试验点可分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验处理3 次，其他处理1 次[16]，将每次试验所得的苏氨酸铬产率列于表2。

采用SAS V8.0软件对表2中的试验结果进行多元回归拟合，初步建立模型的二次多项回归方程为：

采用SAS V8.0软件的RSREG程序对表2中试验结果进行响应面分析，经二次回归拟合后，得到回归方程方差分析见表3，可观察模型各个变量之间的拟合程度。在回归方程的一次项中，各因素对苏氨酸铬产率的影响程度从大到小依次为：X1、X2、X3和X4，其中X1、X2对苏氨酸铬产率影响达到极其显著水平（P＜0.000 1），X3和X4对苏氨酸铬产率影响不显著（P＞0.05）。在二次项中，因素X1达到极其显著水平（P＜0.000 1），因素X2、X3达到高度显著水平（P＜0.01），因素X4达到显著水平（P＜0.05）。在交互项中，各因素之间的交互影响不显著（P＞0.05）。

表 2 Box-Behnken试验方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由回归方程的显著性分析可以得出总模型F=99.61，相应的概率值P＜0.000 1，该方程模型达到极其显著。失拟项F=5.19，相应的概率值P=0.172 3＞0.05，失拟不显著，结果证明该回归方程无失拟因素存在，回归模型与实测值能较好地拟合。此外，该模型的复相关系数R2为99.15%，校正后为98.15%，说明方程拟合较好，并且变异系数较低，为1.52，表明试验的精确度较高，可靠性强。综上所述，回归方程给苏氨酸铬产率提供了一个非常合适的模型[24]。

表 3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation

2.2.2 交互影响因素显著性分析

从响应面图中可以更直观看出各因素对响应值的影响，令其他因素水平值为零，仅考虑两个因素对产率的影响，得到相应的响应面图，如图5所示。

图 5 各因素交互作用的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of different parameters on the yield of chromium threoninate

从响应面图来看，响应面开口向下，响应值随着每个因素的增大而增大，当增大到极值点后，它又随着因素的增大而逐渐减小。这个结果说明此模型有稳定点，且这个稳定点是最大值。对稳定点进行规范分析，结果见表4。

表 4 稳定点的规范分析Table 4 Canonical analysis of stationary point

2.2.3 回归模型的验证

采用表4中各因素的实际值进行3 次平行的验证实验，实验结果苏氨酸铬产率为（68.73±0.10）%，与理论值的相对误差为0.13%，实际产率与理论值非常接近，说明该方程与实际情况拟合很好。可以用该方程代替真实实验点进行分析。

3 结 论

通过响应面法优化苏氨酸铬合成工艺为：反应体系pH 6.11、苏氨酸与氯化铬物质的量比3.86∶1、反应温度93.52℃、反应时间3.25 h。在此条件下苏氨酸铬产率为68.73%。实测值与回归模型预测值（68.82%）相对误差为0.13%，说明采用响应面法优化得到的合成条件可靠。

在氨基酸微量元素的制备过程中，由于微量元素本身的特性及络（螯）合反应的分步性和不完全性、生产工艺的原因，氨基酸微量元素产品的产率有时会偏低[25]，可以采取多次重复反应、生产过程中的结晶母液循环使用的措施，使反应完全，达到提高产率的目的[13,26]。

三价铬是哺乳动物必需的微量元素之一，随着吡啶酸铬、芳香族有机酸铬、脂肪族有机酸铬、氨基酸铬、酵母铬等其他有机铬螯合物多种具有生物活性的有机铬产品相继被研制开发，在医药、保健品和饲料添加剂等方面得到广泛应用，新型高附加值、高生物活性和环境友好的有机铬产品研发和应用显得尤为迫切[27-28]。苏氨酸铬在补充铬的同时，还兼具补充人体必需氨基酸的目的，它在动物养殖、调节血糖等方面已显示优异的性能，因此，实验通过探索苏氨酸铬的合成工艺，希望能为铬营养强化剂的开发提供理论依据。

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Optimization of Synthesis of Chromium Threoninate by Response Surface Methodology

HU Xiaobo, WANG Guangran, JIANG Wenwen, GONG Yi, XIE Mingyong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Chromium threoninate is a new type of chromium supplement. It was prepared by adding chromium chloride to an aqueous solution of threonine. By combined use of single factor method and response surface methodology with a Box-Behnken design involving four factors with three levels, the optimal synthesis conditions were determined as reaction between threonine and chromium chloride with a molar ratio of 3.86:1 for 3.25 h at pH 6.11 and 93.52 ℃. Under these conditions, the actual yield of chromium threoninate was 68.73%, similar to the expected value (68.82%) with a relative error of 0.13%, suggesting the reliability of the optimized synthesis conditions.

chromium threoninate; synthesis; response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630（2015）02-0036-05

10.7506/spkx1002-6630-201502007

2014-06-30

江西省自然科学基金项目（20132BAB204002）；江西省重大科技创新研究项目（20124ACF00400）；

江西省教育厅产学研合作项目（GJJ11002）

胡晓波（1971—），女，副教授，博士，研究方向为食品化学与营养。E-mail：hxbxq2005@163.com

*通信作者：谢明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向为食品营养学、食品安全、功能保健食品。E-mail：myxie@ncu.edu.cn