慢性乙型病毒性肝炎患者抗病毒治疗中细胞免疫功能的改变

赵晓春，郭熙清，刘书宏，安 选，梁尘格，王 辉

(重庆三峡中心医院肝病中心，重庆 404000)

慢性乙型肝炎是全球性疾病，病发率一直居高不下。患者体内特异性CD4+T淋巴细胞的应答性降低，引起细胞免疫功能低下，使得免疫细胞不能对乙型肝炎病毒(HBV)病毒进行有效的清除，导致患者发生持续的肝损害，部分患者可能发生肝硬化甚至肝部癌变，严重威胁慢性乙型肝炎患者的健康安全［1－2］。临床上常采用口服核苷(酸)类似物对慢性乙型肝炎患者进行抗病毒治疗，虽然能够取得较显著的疗效，但治疗后是否会对患者的细胞免疫功能产生影响仍未十分明确，且使用核苷类似物对抗病毒治疗产生的效应是否与机体细胞免疫功能存在相关性，仍有待探究。因此，本研究通过探究慢性乙型肝炎患者在抗病毒治疗中细胞免疫功能的改变情况，旨在为慢性乙型肝炎的临床相关诊断与治疗提供更多参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2010年3月至2011年3月期间收治的90例行核苷(酸)类似物抗病毒治疗的乙肝e抗原(HBeAg)阳性慢性乙型肝炎患者作为本次研究的对象，且均符合2010年版的《慢性乙型肝炎防治指南》［3］。男性49例，女性41例，年龄19～72岁，平均年龄(31.21±11.42)岁。纳入标准:(1)预计生存期＞6个月;(2)入院前48周内未使用任何抗病毒药物、胸腺肽等免疫调节剂进行治疗。排除标准:合并结核病、其他类型肝炎、自身免疫性疾病及肝恶性肿瘤患者。

1.2 方法 所有患者均服用10 mg阿德福韦酯进行抗病毒治疗，以治疗48周为一疗程，并采集治疗前、治疗12、48周后的检测标本，检测外周血T细胞亚群水平、HBeAg转阴情况、病毒载量等。

1.2.1 T细胞亚群检测方法 于流式试管中加入100 μL抗凝血CD4异硫氰酸荧光(fluorescein isothiocyanate，FITC)、CD8藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、CD3多甲藻黄素—叶绿素—蛋白质复合物等20 μL三标记单克隆荧光抗体，均由美国BD公司提供，经避光反应、红细胞裂解、离心、弃上清后，加入1 mL磷酸盐缓冲液，1 000×g离心5 min，弃上清后，再补入磷酸盐缓冲液500 μL，充分混匀后，使用BD FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，以SSC/CD3作为设门，分别记录抑制/细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD4－CD8+)与辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+CD8－)等的百分比，并计算辅助/抑制T淋巴细胞(CD4+/CD8+)的比值。

1.2.2 分组方法及HBV-DNA的检测 根据治疗前HBVDNA测定的载量，将病毒载量为105～106U·mL－1作为DNA低拷贝组，以病毒载量为≥107U·mL－1作为DNA高拷贝组。根据治疗治疗48周后的HBV-DNA及HBeAg转阴情况，分为DNA转阴组与DNA未转阴组、HBeAg转阴组与HBeAg未转阴组。使用ABI 7300荧光定量PCR分析仪器(美国ABI公司)对治疗前后患者的HBV-DNA进行测定，采用达安基因公司提供的检测试剂盒，并按照试剂盒操作说明书进行测定。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0进行统计分析。计量资料用(±s)表示，两组间的比较为成组t检验，多时点间的比较采用重复测量的方差分析，均以P＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前不同HBV-DNA载量患者的T细胞亚群对比抗病毒治疗前DNA低拷贝组患者共34例(37.78%)，DNA高拷贝组患者56例(62.22%)，低拷贝组患者的CD4+百分率、CD8+百分率、CD4+/CD8+比值分别与DNA高拷贝组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.2 抗病毒治疗中T细胞亚群的改变 抗病毒治疗中T细胞亚群的改变均为多时点重复观测资料，统计分析如下。

整体分析(单因素重复测量方差分析)知:经球型性检验并以HF系数调整检验的自由度后，整体分析无显著性意义(P＞0.05);精细比较(时点间两两比较，配对t检验)知:各时点两两比较，均有统计学意义(P＜0.05);结合数据来看:随着抗病毒治疗的进行，患者T细胞亚群失衡情况得到逐步的改善，治疗前、治疗12、48周后的 CD4+百分率、CD4+/CD8+比值对比，差异均有统计学意义(P＜0.05)，治疗48周后的CD4+百分率、CD4+/CD8+比值明显高于治疗前，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表1 治疗前不同HBV-DNA载量患者的T细胞亚群对比(±s)

表1 治疗前不同HBV-DNA载量患者的T细胞亚群对比(±s)

组别 例数 CD4+百分率/%CD8+百分率/% CD4+/CD8+DNA低拷贝组34 36.51 ±9.20 24.98 ±8.47 1.52 ±0.84 DNA 高拷贝组 56 52.81 ±8.90 29.58 ±8.29 1.07 ±0.66 t，P — 8.250，0.000 2.518，0.014 0.664，0.010

表2 抗病毒治疗中T细胞亚群的改变对比(±s)

表2 抗病毒治疗中T细胞亚群的改变对比(±s)

注:与治疗前 CD4+百分率、CD4+/CD8+比值相比:*t1=3.323，*P1=0.001;*t2=2.817，*P2=0.005。

时间 CD4+百分率/% CD8+百分率/% CD4+/CD8+治疗前34.21 ±8.82 26.71 ±8.61 1.26 ±0.75治疗12 周 35.40 ±8.41 26.10 ±8.31 1.35 ±0.82治疗48 周 37.91 ±9.31* 25.18 ±8.10 1.51 ±0.87*F，P 6.532，0.000 1.252，0.089 6.510，0.000

2.3 治疗48周后HBV-DNA、HBeAg转阴与未转阴患者的T细胞亚群对比 治疗48周后HBV-DNA转阴患者共60例，其CD4+/CD8+比值显著高于HBV-DNA未转阴患者;HBeAg转阴患者共35例，其CD4+/CD8+比值显著高于HBeAg未转阴患者，差异均有统计学意义(P＜0.05);HBeAg转阴与未转阴患者的CD8+百分率相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，HBV-DNA转阴与未转阴患者的CD8+百分率相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 治疗48周后HBV-DNA、HBeAg转阴与未转阴患者的T细胞亚群对比(±s)

表3 治疗48周后HBV-DNA、HBeAg转阴与未转阴患者的T细胞亚群对比(±s)

组别 例数 CD4+百分率/% CD8+百分率/% CD4+/CD8+HBV-DNA 转阴60 42.01 ±8.02 24.31 ±8.59 1.71 ±0.65未转阴 30 37.81 ±8.39 25.88 ±8.31 1.39 ±0.66 t，P — 2.271，0.027 0.835，0.407 2.111，0.039 HBeAg 转阴 35 42.61 ±8.51 24.10 ±8.31 1.73 ±0.60未转阴 55 38.29 ±9.10 25.49 ±8.87 1.45 ±0.65 t，P — 2.285，0.025 0.753，0.454 2.089，0.040

3 讨论

已经有研究［4］表明，细胞免疫功能紊乱是慢性乙肝患者病理损伤的主要机制之一。人体的T淋巴细胞主要由CD4+T细胞、CD8+T细胞组成，对于健康机体的外周血T淋巴细胞亚群会保持平衡，但对于HBV病毒感染患者，其外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞等的数量及占比均会发生改变，T淋巴细胞开始重新分布，进而引起机体出现免疫应答反应，对肝细胞产生损伤性作用，最终影响了该类患者病情的发展与疾病的转归。本研究结果发现，治疗前DNA低拷贝组CD4+百分率、CD8+百分率、CD4+/CD8+比值与DNA高拷贝组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。在吴刚等［5］的研究中，亦观察到类似结果。有研究［6］证实，当机体受到HBV病毒感染后，淋巴细胞亚群的平衡状况受到严重影响，慢性乙肝患者CD4+细胞构成比下降，CD8+细胞的百分率上升，CD4+/CD8+比值降低，这对彻底清除HBV病毒造成较大的阻碍，容易引起患者出现肝炎反复性发作，此外，对于HBV病毒高水平载量的患者，其细胞免疫功能的发挥被抑制，最终在体内形成一种恶性循环。特异性与非特异性是机体清除HBV病毒的两种细胞免疫机制，而肝炎慢性化主要是由于细胞免疫功能异常、HBV病毒在肝脏内不断发生复制［7］，故分析细胞免疫功能的改变情况是探究治疗方向的基础。

临床上治疗慢性乙型肝炎患者往往采用核苷(酸)类似物进行抗病毒治疗，但治疗过程中能否抑制上述恶性循环的持续，进而恢复患者的细胞免疫功能?该问题已经逐渐成为临床研究的重点，对制定正确的抗病毒治疗方案具有重要意义。本研究在对慢性乙肝患者行抗病毒治疗时采用了核苷(酸)类药物进行抗病毒治疗，主要包括阿德福韦酯、恩替卡韦等药物，具备耐药性低、药价低廉等优点，已经被证实可显著改善患者淋巴细胞亚群失衡状态［8］。本研究对该药物治疗过程中的T淋巴细胞亚群相关指标进行观察，观察结果发现，随着治疗的进行，患者T细胞亚群失衡情况得到逐步的改善，治疗前、治疗12、48周后的CD4+百分率、CD4+/CD8+比值对比，差异均有统计学意义(P＜0.05)，且治疗96周后的CD4+百分率、CD4+/CD8+比值明显高于治疗前，差异有统计学意义(P＜0.05)，这与黄少军等［9］的报道结果基本一致。此外，本研究结果显示，治疗48周后HBV-DNA转阴患者的CD4+/CD8+比值显著高于 HBVDNA未转阴患者，HBeAg转阴患者的CD4+/CD8+比值显著高于HBeAg未转阴患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，这与相关文献［10］报道结果相符，提示该类患者在进行抗病毒治疗过程中细胞免疫水平与疗效可能存在密切的相关性。本研究经过48周的治疗，患者的细胞免疫功能基本得到恢复，尤其是对于治疗产生应答的患者，其HBV病毒得到较大程度的抑制，进而打破了细胞免疫功能被抑制的恶性循环。但在本研究中发现，HBeAg转阴与未转阴患者及HBV-DNA转阴与未转阴患者的CD8+百分率分别相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)，这可能与受到观察时间长度限制有关，本研究对患者的随访检测持续时间仅为抗病毒治疗48周后，而慢性乙型肝炎患者治疗更长时间后的CD4+百分率、CD8+百分率、CD4+/CD8+比值等是否会发生更明显的变化，是本研究下一步观察的方向，同时这也在另一方面提示，随着慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的不断进行，该类患者的外周血T细胞亚群失衡状况可能会得到更明显的恢复。

综上所述，对抗病毒治疗有应答的慢性乙型肝炎患者，其细胞免疫功能恢复明显，随着抗病毒治疗的进行，T细胞亚群失衡得到显著的改善。

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