毛细管电泳-电化学发光分离检测辣椒粉中罗丹明B

屈忠凯，邓光辉*，王士伟，王 辉，方梦霞，韦福赛，刘清鸿

（广西民族大学化学化工学院，广西高校化学与生物转化过程新技术重点实验室，广西 南宁 530006）

毛细管电泳-电化学发光分离检测辣椒粉中罗丹明B

屈忠凯，邓光辉*，王士伟，王 辉，方梦霞，韦福赛，刘清鸿

（广西民族大学化学化工学院，广西高校化学与生物转化过程新技术重点实验室，广西 南宁 530006）

建立一种以三联吡啶钌（Ru(bpy)32＋）为发光体系的毛细管电泳-电化学发光检测系统，并将其应用于分离和测定辣椒粉中的罗丹明B含量。考察检测电压、Ru(bpy)32＋溶液浓度、磷酸盐缓冲液的pH值和浓度、分离电压、进样电压与进样时间等因素对分离检测的影响。结果表明：在检测电压1.14 V、Ru(bpy)32＋溶液浓度5 mmol/L、磷酸盐缓冲溶液浓度20 mmol/L（pH 8.0）、进样时间10 s、进样电压10 kV、分离电压15 kV条件下，罗丹明B在6 min中得到分离。方法的线性范围为5×10—7～5×10—5mol/L，检出限为1×10—7mol/L（RSN=3）。对1.0×10—5mol/L的罗丹明B标准溶液连续测定5 次，迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为3.2%和1.5%。该方法可成功应用于辣椒粉中罗丹明B含量的测定。

毛细管电泳；电化学发光；辣椒粉；罗丹明B

罗丹明B，又称玫瑰红B，是一种鲜桃红色的人工合成的染料，化学结构式如图1所示，常被用作工业 染色剂、荧光试剂[1-2]和实验分析指示剂[3]，属于非食品原料。实验证明罗丹明B会致癌，可引起诱变或致畸[4-5]。中国卫生部已经将其列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》，日本以及欧美等国家和地区均已禁止在食品及食品相关产品中使用[6]。

由于罗丹明B价格低廉、色泽鲜艳、稳定性强特点[7]，不法商贩为了牟取暴利，违法使用罗丹明B染料对辣椒以及辣椒制品进行染色，以假乱真，欺骗消费者，危害消费者的身体健康。因此，对辣椒中罗丹明B的检测显得十分重要。目前对于罗丹明B的分析方法主要有液相色谱法[8-11]、液相色谱-串联质谱法[12-15]、高效液相色谱荧光检测法[16-19]、薄层色谱法[20]和分光光度法[21-22]等。而我国目前尚无检测食品中罗丹明B的国家标准，2010年实施的SN/T 2430—2010《进出口食品中罗丹明B的检测方法》[23]中需要使用凝胶色谱，费用昂贵，并且整个检测过程工作量大，液相色谱法前处理复杂，分光光度法选择性差，质谱仪价格昂贵，普及程度不高。因此为了有效控制其在食品中的滥用，需要建立一种操作简单、快速、高灵敏度检测罗丹明B的方法。毛细管电泳-电化学发光法与上述方法相比具有进样量少、选择性高、灵敏度高、绿色环保等优点[24-25]，本实验采用毛细管电泳-电化学发光法对辣椒粉中的罗丹明B含量进行测定，方法灵敏度和准确度高、重复性好、简便、快速，为合理评价辣椒粉质量提供了一种可靠的分析方法。

图1 罗丹明B的分子结构式Fig.1 Molecular structure of rhodamine B

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗丹明B标准品（含量99.5%） 中国食品药品检定研究院；辣椒粉 南宁沃尔玛超市；三联吡啶钌六水合氯化物（Ru(bpy)3Cl2・6H2O，含量99%） 美国Alfa Aesar公司；磷酸二氢钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂公司；二次蒸馏水实验室自制。

1.2 仪器与设备

MPI-A型毛细管电泳-电化学发光检测仪（配有电化学检测池、0.05 μm Al2O3粉末、专用铂盘检测电极（300 μm i.d）、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极组成的三电极系统） 西安瑞迈分析仪器有限责任公司；0.45 μm聚醚砜滤膜 上海嘉措仪器设备有限公司；未涂层石英毛细管（50 μm×50 cm） 河北永年光导纤维厂；TP-214电子分析天平 丹佛分析仪器公司；PHS-3C pH计 上海雷磁公司；KQ-100DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；1810-B型自动双重水蒸馏器 金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 毛细管电泳-电化学发光检测条件

未涂层石英毛细管（350 μm×50 cm，50 μm）每次使用前用0.1 mol/L NaOH溶液冲洗毛细管5 min，二次蒸馏水冲洗5 min，运行缓冲液冲洗10 min。溶液进入毛细管前需用0.45 μm聚醚砜滤膜过滤。铂检测电极使用前需用0.05 μm Al2O3粉末进行抛光处理，置于水中超声波清洗干净，清洗后用光学显微镜观察使其与毛细管对接，对接距离在（100±20） μm。电化学发光反应在检测池中进行。实验前检测池中充满5 mmol/L Ru(bpy和80 mmol/L 磷酸盐（phosphate buffered saline，PBS）溶液（pH 8.0）共350 μL，实验过程中每运行3次更换新鲜溶液，并取出工作电极，用0.05 μm Al2O3粉末重新抛光，以保证实验重复性。运行缓冲液为20 mmol/L PBS溶液（pH 8.0）。毛细管分离电压15 kV、进样电压10 kV、进样时间10 s、光电倍增管高压800 V。

1.3.2 对照品溶液的制备和样品的提取及制备

准确称取罗丹明B标准品2 mg，用乙醇定容为50 mL作为标准储备液，用时适当稀释。

准确称取干燥辣椒粉末 （过65 目）约2 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加入75%乙醇溶液20 mL，超声处理（功率100 W、频率50 kHz）30 min，冷却，取上清液至离心管中，10 000 r/min离心10 min，样品用0.45 μm聚醚砜滤膜过滤，待用。

2 结果与分析

2.1 罗丹明B与吡啶钌发光体系的电化学发光行为

图2 罗丹明B循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammogram of rhodamine B

以20 mmol/L磷酸盐PBS溶液（pH 8.0）配制5 mmol/L Ru(bpy)溶液，在0.40～1.30 V范围内采用循环伏安法扫描，扫速为0.05 V/s，工作电极为铂电极，测试罗丹明B对Ru(bpy化学发光的影响。实验显示罗丹明B溶液在碱性条件微弱的电化学发光现象，发光强度为100～200。当Ru(bpy溶液加入罗丹明B后，电化学氧化峰有增强现象（图2），电化学发光强度比未加时增强了4 倍（图3），表明罗丹明B与Ru(bpy)32＋发生共发光反应，故可以通过测量发光强度的变化用于罗丹明B定量分析。

图3 罗丹明B电化学发光图Fig.3 Electrochemiluminescence of rhodamine B

2.2 电化学发光检测电压的影响

检测电压是影响发光强度的一个重要因素。电泳实验条件为分离电压15 kV，罗丹明B标准溶液电动进样10 s（进样电压10 kV），固定其他参数不变，考察1.10～1.20 V范围对罗丹明B发光强度的影响。1.10～1.14 V范围内，发光强度随着检测电压增大而增大，当检测电压为1.14 V时发光强度最高，超过1.14 V，发光强度反而减少，故选择1.14 V为优化的检测电压。

2.3 运行缓冲液浓度与pH值的影响

图4 运行缓冲液浓度（A）和pH值（B）对电化学发光强度的影响Fig.4 Effects of concentration and pH of running buffer on ECL intensity

固定PBS缓冲液的pH 8.0，考察PBS的浓度在10～35 mmol/L范围内对发光强度的影响。由图4可见，PBS缓冲液的浓度在20 mmol/L时发光强度最大，因此选择20 mmol/L作为最佳浓度。固定PBS缓冲液浓度为20 mmol/L，考察其pH 6.8～8.8范围内对发光强度的影响。实验得知，pH 6.8～8.0范围内时，电化学发光强度随着pH值增大而增大。pH 8.0时，发光强度最大，pH值大于8.0时，发光强度反而减小，因此选择8.0作为最佳pH值。

2.5 分离电压、进样电压与进样时间的影响

分离电压主要影响迁移时间，电压越高，迁移时间越短。实验主要考察分离电压在8～18 kV内对样品迁移时间和分离的影响。综合考虑峰宽、灵敏度、噪音、焦耳热及分析时间等因素，选择15 kV作为分离电压。

罗丹明B进样方式采用电动进样，在进样电压为10 kV的条件下，考察不同进样时间对电化学发光强度、迁移时间和峰宽等的影响。结果表明，随着进样时间的延长，电化学发光强度增强，峰变宽，迁移时间延长，当进样时间超过10 s后，电化学发光强度峰高度无明显增强。本实验选择峰面积进行定量，峰展宽会使测量误差增大，综合考虑，因此选择进样时间为10 s。

固定进样时间为10 s，在6～14 kV范围内考察进样电压对电化学发光强度影响。实验得知，进样电压在6～10 kV时， 电化学发光强度随着进样电压增大而增大。在10～14 kV时，电化学发光强度随着进样电压增大反而减小，而且峰形变差。所以，选择10 kV作为进样电压。

2.6 线性范围、检出限与精密度

配制一系列浓度的罗丹明B的标准溶液在优化好的实验条件下进行实验，各浓度标准溶液连续进样3 次，计算峰面积的平均值。以浓度（μmol/L）为横坐标x，对应峰面积y为纵坐标作图，得到线性回归方程、 线性范围和检出限见表1。

表1 线性方程、相关系数、线性范围和检出限Table1 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges and Table 1 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges and detection limits mits

在最优条件下对罗丹明B标准溶液进行分离检测，连续进样5 次，得到罗丹明B的迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为3.2%和1.5%，说明方法的精密度良好。罗丹明B标准溶液毛细管电泳图见图5。

图5 罗丹明B标准品毛细管电泳-电化学发光法图Fig.5 CE-ECL electropherogram of rhodamine B

2.7 样品分析

图6 辣椒粉样品（a）和辣椒粉样品加标罗丹明B（bb）的毛细管电泳-电化学发光法图Fig.6 CE-ECL electropherograms of (a) blank chili power and (b) chili power spiked with 120 μg of rhodamine B

辣椒粉样品电泳图见图6a，本实验中未发现辣椒粉中含有罗丹明B，样品加标图见图6b，样品加标回收实验结果见表2。电泳条件为分离电压15 kV、进样电压10 kV、进样时间10 s、运行缓冲液浓度20 mmol/L、pH 8.0、检测电压1.14 V、Ru(bpy)32＋溶液浓度5 mmol/L。

表2 回收率实验（n==33）Table2 Results of recovery tests (n == 33))

3 结 论

由于罗丹明B具有叔胺官能团，对Ru(bpy)32＋的电化学发光信号有增敏作用，因此可以利用Ru(bpy)32＋电化学发光方法检测。本实验在检测电压1.14 V、Ru(bpy)32＋溶液浓度5 mmol/L、PBS缓冲溶液浓度20 mmol/L （pH 8.0）条件下，建立了罗丹明B的毛细管电泳-电化学发光法检测法，并将其应用于辣椒粉中罗丹明B含量分析，其检出限低于液相色谱法和分光光度法。此法具有操作简单、所需试剂量少、检测快速、专属性强等优点。

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Separation and Determination of Rhodamine B in Chili Power by Capillary Electrophoresis with Electrochemiluminescence Detection

QU Zhongkai, DENG Guanghui*, WANG Shiwei, WANG Hui, FANG Mengxia, WEI Fusai, LIU Qinghong
(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Chemical and Biological Transformation Process Technology, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nannin g 530006, China)

A sensitive and simple method based on capillary electrophoresis (CE) with electrochemiluminescence (ECL) detection has been developed for the separation and determination of rhodamine B in chili power. The effects of detection potential, the concentration of Ru(bpy)32+, the acidity and concentration of the running buffer, separation voltage and injection time were investigated to acquire the optimum conditions. The detection electrode was a 300 μm diameter platinum microelectrode at a detection potential of 1.14 V (versus Ag/AgCl). Rhodamine B could be well separated within 6 min in a 50 cm length fused-silica capillary at a separation voltage of 15 kV in a 20 mmol/L PBS buffer (pH 8.0). The response range of rhodamine B was from 5 × 10-7to 5 × 10-5mol/L with a detection limit of 1 × 10-7mol/L (RSN= 3). The proposed method demonstrated long-term stability and reproducibility with relative standard deviations (RSD) of less than 3.5% for both migration time and electrophoretic peak area (n = 5). This method can be successfully applied t o the analysis of rhodamine B in chili power with satisfactory assay results.

capillary electrophoresis; electrochemiluminescence; chili power; rhodamine B

O657.8

A

1002-6630（2015）04-0217-04

10.7506/spkx1002-6630-201504043

2014-05-07

广西高校人才小高地建设创新团队资助计划项目（桂教人[2011]47号12）

屈忠凯（1988—），男，硕士研究生，研究方向为色谱与毛细管电泳。E-mail：qzk1016@163.com

*通信作者：邓光辉（1957—），男，教授，硕士，研究方向为现代分离分析技术。E-mail：dgh321@163.com