克罗诺杆菌分子鉴定方法的比较

迟涛，方景泉，满朝新，许慧

（1.国家乳业工程技术研究中心，黑龙江省乳品工业技术开发中心东北农业大学，哈尔滨150028；2.国家大豆工程技术研究中心黑龙江省大豆技术开发研究中心东北农业大学，哈尔滨150028）

0 引言

克罗诺杆菌（原名阪崎肠杆菌）属于肠杆科，是一种周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞机会性致病菌，能够感染婴儿和成人[1,2]。更重要的是，克罗诺杆菌属于婴儿配方乳粉（PIF）中的A类致病菌，新生儿尤其是体重较轻的早产儿摄入被克罗诺杆菌污染的PIF后，会导致严重的坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病，死亡率高达40%～80%[3-5]。克罗诺杆菌的鉴定方法有很多，如显色培养基和API2.0E系统，然而这些根据克罗诺杆菌理化性质建立的鉴定方法不能从分子生物学角度对克罗诺杆菌进行鉴定[6]。本研究利用16S rRNA及看家基因fusA从分子生物学角度对克罗诺杆菌进行鉴定，并比较这两种方法的优缺点，从而为克罗诺杆菌的鉴定提供理论支持。

1 实验

1.1 材料

试验菌株：本实验保存的分离自婴儿配方乳粉的11株克罗诺杆菌，并选择阴沟肠杆菌ATCC 35030、产期肠杆菌ATCC 3048、大肠杆菌O157和大肠杆菌CMCCB 44113作为参考株。

主要试剂：营养肉汤（NB），胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），琼脂糖，分子试剂，细菌全基因组DNA提取试剂盒，2×Taq PCR Master Mix（含染料），双蒸水。

主要仪器：QT-1型旋涡混合器，水浴锅，PL203型电子分析天平，洁净工作台VD-1320，DYY-10C型电泳仪，UVP凝胶呈相系统。

1.2 方法

1.2.1 克罗诺杆菌的活化与纯化

取出-20℃甘油保存的含有克罗诺杆菌的冻存管，将菌株恢复至室温后，按2%的接种量接种于NB液体培养基，37℃培养8～12 h进行活化。若菌株为单一菌体，活化后即可进行后续试验，若活化菌株不纯需进行纯化后才能进行后续试验，即将活化后的菌株在TSA固体培养基上进行三区划线，37℃培养24 h后挑取单菌落，置于10 mL液体NB培养基中进行纯培养，连续传代2次后即可进行后续试验。

1.2.2 克罗诺杆菌DNA的提取

取2 mL克罗诺杆菌的NB培养液，按照天根细菌全基因组DNA试剂盒的说明书进行克罗诺杆菌DNA的提取，并将提取的DNA置与-20℃冰箱中保藏备用。

1.2.3 克罗诺杆菌16S rRNA的PCR扩增

以克罗诺杆菌总DNA为模板，利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列如表2-1。PCR的反应体积为50 μL，反应体系为：模板2 L，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix（含染料）25 uL，双蒸水21 uL。反应条件：94℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 S，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循环30次，最后72℃延伸7 min。样品置于4℃冰箱内保存，PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，UVP凝胶成像系统拍照记录结果。

表1 引物序列

1.2.4 克罗诺杆菌fusA基因的PCR扩增

以克罗诺杆菌总DNA为模板，利用fusA特异性引物进行PCR扩增，引物序列如表1所示。PCR的反应体积为50 μL，反应体系为：模板2 uL，上下游引物各1 uL，2×Taq PCR Master Mix（含染料）25 μL，双蒸水21 μL。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸5 min[6]。样品置于4℃冰箱内保存，PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，UVP凝胶成像系统拍照记录结果。

1.2.5 克罗诺杆菌生物信息学分析

将PCR产物送往，进行基因测序，得到克罗诺杆菌的序列。将16 S rRNA的序列在NCBI中进行比对，进行克罗诺杆菌的鉴定；将fusA的序列在克罗诺杆菌数据库中进行比对（http：//pubmlst.org/cronobacter/）得到fusA基因的等位基因号。并利用MEGA6软件对克罗诺杆菌的16S rRNA和fusA基因进行系统发育分析，选用最大似然算法，重复1 000次[7]。

2 结果与讨论

2.1 克罗诺杆菌16S rRNA的分析

将克罗诺杆菌16S rRNA的测序结果在NCBI上进行比对，11株克罗诺杆菌的比对结果如表2所示；利用MEGA6软件对11株和4株参考株进行系统发育分析，其系统发育树如图1所示。

由表2可以看出，11株菌株中9株被鉴定为阪崎克罗诺杆菌，而编号为7和11的菌株经过blast比对，为阪崎克罗诺杆菌和丙二酸阳性克罗尼杆菌的可能都为99%。通过11株克罗诺杆菌的系统发育树可知，利用16S rRNA的通用引物对克罗诺杆菌进行分析，可以很好的与其他血缘相近的微生物区分，但是在克罗诺杆菌内的辨识度不强，呈现相近的系统发育关系。

表2 11株克罗诺杆菌NCBI比对结果

图1 11株克罗诺杆菌16S rRNA最大似然系统发育树

2.2 克罗诺杆菌fusA基因的分析

将克罗诺杆菌fusA的测序结果在克罗诺杆菌数据库中进行比对，11株克罗诺杆菌fusA的等位基因号分别为1，7，8，11，12，13，14，15，16，17和37；其中根据比对9株为阪崎克罗诺杆菌，2株为丙二酸阳性克罗诺杆菌。利用MEGA6软件对11株和4参考株的fusA基因进行系统发育分析，其系统发育树如图2所示。图2呈现出了清晰的系统发育关系，其中等位基因fusA为7和13的丙二酸阳性克罗诺杆菌在系统发育关系中远离了阪崎克罗诺杆菌，这说明利用fusA基因可以将克罗诺杆菌进行种种之间的鉴定。

图2 11株克罗诺杆菌fusA基因最大似然系统发育树

2.3 两种鉴定方法的比较

16S rRNA是传统的微生物鉴定的分子方法，与基于理化检验的鉴定方法相比，它具有其自身的优越性。16S rRNA的分子鉴定方法是基因微生物16S rRNA序列排列的，可以从分子层面对微生物进行定性分析。然而，由于16S rRNA的特异性不强且多样性并不丰富，很难将待鉴定的微生物精确到种的水平，且容易产生误差[9]。由于克罗诺杆菌不同种之间最少的共享性，fusA基因可以用来克罗诺杆菌的鉴定，并且利用fusA基因对325株克罗诺杆菌进行了鉴定，并且区分到了种的水平[8]。此外xXiaoke Xu等人也利用fusA基因对克罗诺杆菌进行了鉴定，基于fusA的鉴定方法越来越被人们认可[10]。本研究选取了具有代表意义的克罗诺杆菌进行了鉴定，其中利用16S rRNA的鉴定方法不能将11株克罗诺杆菌精确到种，而基于fusA的鉴定方法能将克罗诺杆菌精确到种，这也证明了看家基因fusA在克罗诺杆菌的分子鉴定中具有优越性。

3 结论

克罗诺杆菌具有感染婴儿和成人的能力，能够通过污染婴儿配方乳粉感染新生儿，尤其是体重较轻的早产儿，一旦被感染会引起严重的坏死性小肠结肠炎、脓血症、脑膜炎等疾病，严重威胁婴幼儿的健康。

本实验选取11株分离自婴儿配方乳粉中的克罗诺杆菌为研究对象，利用16S rRNA和看家基因fusA对克罗诺杆菌进行分子层面的鉴定，并得到了两者清晰的系统发育关系，结果表明两种分子鉴定的方法都能对克罗诺杆菌进行鉴定，且基于看家基因fusA的鉴定方法具有更高的辨识度，能将克罗诺杆菌的鉴定精确到种。因此利用看家基因fusA对克罗诺杆菌进行分子鉴定具有优越性，本研究的实验结果有助于克罗诺杆菌的分子鉴定，为克罗诺杆菌的进一步研究提供了理论基础。

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