超临界CO2萃取香榧假种皮提取物的工艺优化及其主要成分分析

于勇杰 韩 琴 倪 穗 邬玉芬 桑卫国

（宁波大学海洋学院1，宁波 315211）

（宁波市宁海县林特技术推广总站2，宁海 315600）

超临界CO2萃取香榧假种皮提取物的工艺优化及其主要成分分析

于勇杰1韩 琴1倪 穗1邬玉芬2桑卫国1

（宁波大学海洋学院1，宁波 315211）

（宁波市宁海县林特技术推广总站2，宁海 315600）

采用响应面法优化了超临界CO2流体萃取（SCE）香榧假种皮提取物的工艺，并采用气相色谱质谱联用仪（GC－MS）对其提取物成分进行了分析。在单因素试验的基础上，选取动态萃取时间、萃取温度、萃取压力作为变量，以香榧假种皮提取物得率为指标，采用Box－Behnken试验设计方法进行三因素三水平试验，根据回归方程的预测模型对结果进行响应面分析，确定超临界CO2流体萃取香榧假种皮提取物的优化工艺为：粉碎度40目，静态萃取时间20min，动态萃取时间2.5 h、萃取温度45℃、萃取压力34 MPa，在此条件下提取物平均提取率为（22.12±0.09）%。经过GC－MS检测分析，香榧假种皮提取物的主要成分为二萜类物质，其次为羧酸、酯类、倍半萜类和单萜类物质。

超临界CO2萃取 香榧假种皮 响应面法 气相色谱质谱联用仪

香榧（Torreya grandis cv．merrillii）属红豆杉科（Taxaceae）榧属（Torreya Arn.）裸子植物，第三纪孑遗植物，雌雄异株，常绿乔木，又称榧子、玉榧、细榧、赤果等，在我国浙江、安徽、江苏、福建等省份丘陵地区均有栽培［1］。香榧是我国特有的珍稀干果和优质高产的木本油料作物，具有材用、药用、果用、油用和观赏、绿化等多种用途。

香榧的种子香脆可口、营养丰富，含有丰富的矿物质、维生素、蛋白质，种仁含油率为60%左右，其中不饱和脂肪酸含量达80%以上［2－3］。香榧还具有杀虫消积、润肺化痰、滑肠消痔、健脾补气、去瘀生新等药用价值，《本草纲目》、《本草推陈》、《中国药典》等著作对其药用价值均有记载［4］。香榧种子外部有一层假种皮是不能食用的，约占种实鲜重的50%，目前尚未得到有效的开发利用。据报道，香榧假种中富含二萜类、挥发油、黄酮等活性成分［5－6］。其中挥发油和二萜类物质是制备高级芳香油和浸膏的天然原料，紫杉醇和榧黄素具有抗病毒和抗肿瘤的功效［7－8］。因此将香榧假种皮作为提取天然活性物质的原料，具有极大的应用价值和开发前景。

超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）技术是近年来发展起来的一项新型萃取和分离技术。由于CO2的超临界温度低、无色、无毒、无味、不易燃烧、易制成高纯度气体、价格低廉，且具有较好的溶剂特性［9］，因此 CO2是首选的超临界流体。超临界 CO2流体萃取（Supercritical Carbon Dioxide Extraction，SCE）的天然产物具有较好的提取、分离效果，目前已被广泛应用于天然产物如植物油、香辛香料等天然有效成分的提取［10－12］。本研究采用超临界CO2流体萃取香榧假种皮活性成分，在单因素试验的基础上，利用响应面法（Response Surface Method，RSM）对香榧假种皮中主要物质的提取工艺条件进行优化，并采用GC－MS对提取物主要成分进行分析。以期为香榧假种皮中这些有效物质在医药、日用化学品和食品工业中的利用提供技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验材料：成熟的香榧种子于2013年9月采自浙江宁海榧坑村香榧生产基地20年左右树龄的树上。从成熟的香榧种子上剥离下假种皮，在避光条件下自然阴干、粉碎过不同目数筛，4℃条件下密封避光保存；食品级CO2（纯度＞99.90%）：宁波方辛气体有限公司。

试验仪器：SFE－2型超临界CO2萃取仪：美国Applied Separations公司；QP－2010气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；高速粉碎机：上海江信科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 超临界CO2萃取工艺流程

香榧假种皮→自然阴干→粉碎→过筛→超临界CO2流体萃取→分离→香榧假种皮提取物

精确称取10.00 g香榧假种皮于萃取釜中，设定萃取温度，待温度稳定后通入CO2气体，并调节至一定压力、温度，待稳定后开始进行静态萃取，静态萃取一段时间后开启出口阀，调节CO2流量进行动态萃取，收集萃取物。

1.2.2 香榧假种皮提取物得率的计算

利用减量法计算香榧假种皮提取物得率：

式中：W为香榧假种皮提取物得率／%；m1为萃取前萃取斧的质量；m2为萃取后萃取斧的质量；m为香榧假种皮的质量。

1.2.3 单因素试验

原料粉碎度、萃取温度、萃取压力、萃取时间及CO2流速是影响超临界 CO2萃取得率的主要因素［13－14］。综合考虑设备条件和成本因素，选择粉碎度、静态萃取时间、动态萃取时间、萃取温度、萃取压力等5个主要因素，研究其对香榧假种皮提取物得率的影响。每组试验重复3次，结果取平均值。

1.2.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，固定粉碎度和静态萃取时间，以动态萃取时间（X1）、萃取温度（X2）、萃取压力（X3）作为变量，以＋1、0、－1分别表示自变量的高、中、低水平，以香榧假种皮提取物得率（Y）为响应值，采用 Box－Behnken进行三因素三水平试验设计，对香榧假种皮提取物提取工艺进行优化。响应面分析因素及水平如表1所示。每组试验重复3次，结果取平均值。

表1 响应面分析因素及水平

1.2.5 气相色谱质谱联用分析条件

样品前处理：取10 mg香榧假种皮提取物溶于1mL无水乙醇，滴加1滴1%酚酞乙醇溶液，然后滴加26%四甲基氢氧化铵甲醇溶液至红色30 s内不褪色，进样分析前过0.22μm微孔滤膜。

色谱条件：采用SPB－50石英毛细管气相色谱柱（30.0 m×0.25mm×0.25μm），柱初温40℃保持2min，然后以10℃／min速度升温至130℃，再以5℃／min升温至270℃，保持5min；进样口温度250℃；进样量 1μL；分流比 30∶1；载气为氦气（99.99%）。

质谱条件：电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度200℃，传输线温度250℃，溶剂切除时间3min，扫描范围45～650 u。定性分析经 NIST27和WILEY7质谱图谱检索确定香榧假种皮提取物各组分，采用峰面积归一化法求各成分相对含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 静态萃取时间对萃取得率的影响

在粉碎度20目、动态萃取时间2 h、萃取温度40℃、萃取压力30 MPa条件下，不同静态萃取时间对香榧假种皮提取物得率的影响如图1所示。

图1 静态萃取时间对萃取得率的影响

由图1可以看出，随着静态萃取时间的增加，香榧假种皮提取物得率逐渐增加，但是静态萃取时间超过20min以后，萃取得率增长趋势逐渐变缓，因此选择20min作为适宜的静态萃取时间。

2.1.2 动态萃取时间对萃取得率的影响

在粉碎度20目、静态萃取时间20min、萃取温度40℃、萃取压力30 MPa条件下，不同动态萃取时间对香榧假种皮提取物得率的影响如图2所示。由图2可知，香榧假种皮提取物得率随着萃取时间的延长萃取得率逐渐升高。当时间大于2.5 h时，萃取得率增长缓慢，因此综合考虑能耗和萃取效率，适宜的萃取时间为2.5 h。

图2 动态萃取时间对萃取得率的影响

2.1.3 萃取温度对萃取得率的影响

在粉碎度20目、静态萃取时间20min、动态萃取时间2 h、萃取压力30 MPa条件下，不同萃取温度对香榧假种皮提取物得率的影响如图3所示。

温度对萃取得率的影响主要有两方面：在一定的压力下，温度的升高引起溶质蒸汽压的增长和流体密度的下降。当流体密度下降时，溶质在溶剂中的溶解度下降；当溶质的蒸汽压上升时，组分在溶剂中的溶解性又增强，萃取得率的高低取决于何种状态占优势［15］。由图3可知，萃取得率随着温度的升高逐渐提高，但是温度超高45℃以后，萃取率增加缓慢，因此适宜的萃取温度为45℃。

2.1.4 萃取压力对萃取得率的影响

在粉碎度20目、静态萃取时间20min、动态萃取时间2 h、萃取温度40℃条件下，不同萃取压力对香榧假种皮提取物得率的影响如图4所示。

压力对超临界流体萃取的影响主要表现为：在一定范围内压力升高使CO2流体密度增加，溶解度增加，从而使萃取得率随压力升高而增加；但是压力过高时，物料被压实而增大了传质距离和传质阻力，萃取率降低［15］。由图4可知，随着萃取压力的增加，萃取得率逐渐升高，但是萃取压力超过35 MPa以后，萃取得率随压力的升高而降低。因此，选择萃取压力为35 MPa有利于萃取的进行。

图4 萃取压力对萃取得率的影响

2.1.5 粉碎度对萃取得率的影响

在静态萃取时间20min、动态萃取时间2 h、萃取温度40℃、萃取压力30 MPa条件下，不同粉碎度对香榧假种皮提取物得率的影响如图5所示。

图5 粉碎度对萃取得率的影响

由图5可以看出，粉碎度为20目的原料萃取得率明显高于未粉碎和粉碎度为10目的原料，而粉碎度大于40目以后，萃取得率降低。原因是粉碎度的增加有助于CO2流体向物料内部渗透，减小了传质距离和阻力，有利于萃取的进行；但是粉碎度过大，物料太细，高压条件下原料易被压实，从而增大传质阻力，不利于萃取的进行，因此适宜的香榧假种皮粉碎度为40目。

2.2 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，在粉碎度40目、静态萃取时间20min的条件下，选取动态萃取时间（X1）、萃取温度（X2）、萃取压力（X3）作为变量，以香榧假种皮提取物得率（Y）为指标，采用 Box－Behnken进行三因素三水平试验设计，响应面试验设计方案及结果如表2～表3所示。

表2 响应面试验设计方案及结果

利用Design－expert7.0软件对表2数据进行分析，得到香榧假种皮提取物得率与各变量之间的二次方程模型：Y＝－193.17＋11.74X1＋5.33X2＋4.62X3－0.13X1X2＋0.06X1X3－0.02X2X3－1.62X12－该模型显著性检验及方差分析见表3。

表3 回归方程方差分析

由表3可以看出，模型P＜0.000 1，说明该二次方程模型达到极显著水平；回归系数R2＝0.988 5，说明该模型响应值的变化98.85%来自所选自变量；失拟项P＝0.341 1＞0.05，说明该方程与试验数据拟合较好，将该模型用于香榧假种皮提取物的提取工艺优化是合适的。模型中一次项X1、X2、X3均达到显著水平，二次项对模型影响极显著，交互项X1X2、X2X3交互作用极显著，X1X3之间交互作用不显著，表明各因素对香榧假种皮提取物得率的影响并不是简单的线性关系。模型中对香榧假种皮提取物得率影响的大小顺序依次为X1＞X2＞X3，即动态萃取时间＞萃取温度＞萃取压力。

据模型多元回归方程所作的响应面曲线及等高线图见图6～图8，可以直观地反映各因素之间的交互作用。3个曲面均为开口向下的凸形曲面，自变量X1、X2、X3与香榧假种皮提取物得率呈抛物线关系，且存在考察范围内的极大值。

由图6可以看出，在萃取压力35 MPa条件下，动态萃取时间和萃取温度交互作用极显著（P＜0.01）。低温区，萃取得率随时间的增加呈逐渐上升的趋势，而高温区，萃取得率随时间的增加呈现上升后下降的趋势；低时间区，萃取得率随温度的增加呈逐渐上升的趋势，高时间区，得率随温度的增加呈缓慢上升趋势，当温度达到一定值时，萃取得率变化平缓，后有下降的趋势。说明温度过高或者过低都不利于萃取的进行。

图6 动态萃取时间和萃取温度对提取物得率交互影响的三维曲面图（a）和等高线图（b）

由图7可以看出，在萃取温度45℃条件下，动态萃取时间和萃取压力等高线图呈圆形，说明二者之间交互作用不显著（P＞0.05）。在低压区，萃取得率随时间的增加呈上升趋势，当动态萃取时间达到一定值时，萃取得率变化缓慢；高压区，萃取得率随动态萃取时间的增加呈先上升后下降的趋势。说明萃取初始阶段，动态萃取时间与萃取得率呈正比例关系，当达到一定时间以后，萃取时间对提高得率影响不明显。

图7 动态萃取时间和萃取压力对提取物得率交互影响的三维曲面图（a）和等高线图（b）

由图8可以看出，在动态萃取时间2.5 h条件下，萃取温度和萃取压力之间交互作用显著（P＜0.01）。在低温区和高温区，萃取得率都随压力的增加呈先上升后下降的趋势，说明压力过低或者过高都不利于萃取的进行。

图8 萃取温度和萃取压力对提取物得率交互影响的三维曲面图（a）和等高线图（b）

2.3 最优条件的确定与验证

对所得模型回归方程3个自变量取一阶偏导数等于零，可得 X1＝2.52 h、X2＝45.51℃、X3＝34.49 MPa，因此根据响应面分析结果预测香榧假种皮提取物工艺最优条件为：萃取时间2.52 h、萃取温度45.51℃、萃取压力34.49 MPa，在此条件下预测提取物得率为22.52%。

为检验结果的可靠性，在最优条件下进行验证试验。考虑到实际操作的便利，将工艺参数修正为：萃取时间2.5 h、萃取温度45℃、萃取压力34 MPa，在此条件下进行3次试验，所得平均提取率为（22.12±0.09）%，与理论预测值相对误差为0.04%，说明该模型稳定可靠，具有一定的参考价值。

2.4 香榧假种皮超临界CO2提取物主要成分分析

使用气相色谱质谱联用仪对所得香榧假种皮提取物主要成分及相对含量进行了测定，结果如表4所示。共鉴定了香榧假种皮超临界CO2提取物中的51种成分，约占提取物相对总含量的90.77%。其主要成分为二萜类物质（69.61%），羧酸、酯类成分（12.14%），单萜和倍半萜类（8.96%）。相对含量在较高的成分有：山达海松酸（21.65%）、16，18－贝壳杉烯酸 （13.21%）、海松酸 （5.70%）、新枞酸（4.55%）、7，13，15－枞三烯酸（4.43%）、湿地松酸（4.42%）、脱氢枞酸（3.07%）、枞酸（2.62%）、大根香叶烯 D（1.10%）等。王贝贝等［16］对超临界CO2萃取法香榧假种皮提取物成分进行分析，结果表明香榧假种皮超临界CO2提取物成分主要以二萜类物质为主，与本研究结果一致；但是在化合物种类和含量方面有差异，与之相比，本研究优化提取工艺后得到的香榧假种皮提取物成分种类较多，得到了较多的单萜、倍半萜类化合物，如大根香叶烯D、β－金合欢烯等，能够更全面地反映香榧假种皮提取物成分。

表4 香榧假种皮超临界CO2提取物成分分析结果

表4 （续）

3 结论

3.1 在单因素试验的基础上，选取萃取时间、萃取温度、萃取压力作为Box－Behnken试验设计变量，以香榧假种皮提取物得率为响应值，对香榧假种皮提取物的提取工艺进行优化。结果表明：动态萃取时间、萃取温度、对萃取得率影响极显著（P＜0.01），萃取压力对萃取得率影响显著（P＜0.05），动态萃取时间和萃取温度、萃取温度和萃取压力之间交互作用极显著（P＜0.01），动态萃取时间和萃取压力之间交互作用不显著（P＞0.05）；香榧假种皮提取物的最优提取工艺为：粉碎度40目，静态萃取时间20min，动态萃取时间2.5 h、萃取温度45℃、萃取压力34 MPa，在此条件下进行3次试验，所得平均提取率为（22.12±0.09）%，与理论预测值相对误差为0.04%。

3.2 通过GC－MS测定出香榧假种皮超临界CO2提取物中51种成分，约占提取物相对总含量的90.77%。其主要成分为二萜类物质（69.61%），羧酸、酯类成分（12.14%），单萜和倍半萜类（8.96%）。其中，二萜类物质如新枞酸、山达海松酸、枞酸、湿地松酸、海松酸已被广泛应用于肥皂、造纸、油墨、橡胶等行业。单萜和倍半萜类物质中大根香叶烯D、柠檬烯、Δ－杜松烯等是挥发油的主要成分，可作为香料被广泛应用于食品和化妆品行业。

总之，优化后的超临界CO2流体萃取香榧假种皮提取物工艺对香榧假种皮中的活性物质具有较好的提取、分离效果，该提取工艺将为香榧生产中大宗废弃物假种皮的开发利用提供有利的技术方法。

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Process Optimization and Principal Component Analysis of Extracts from Chinese Torreya by Supercritical CO2Technology

Yu Yongjie1Han Qin1Ni Sui1Wu Yufen2Sang Weiguo1

（School of Marine Sciences，Ningbo University1，Ningbo 315211）
（Ninghai Forestry Technology Extension Station2，Ninghai 315600）

A response surfacemethod（RSM）was used to optimize supercritical CO2extraction（SCE）of the extracts from Chinese Torreya aril and themain components of aril extractswas analyzed by gas chromatograph－mass spectrometer（GC－MS）.Based on the single factor experiments，the dynamic extraction time，extraction temperature and extraction pressure were selected as variables.The extraction yield of Chinese Torreya aril was regarded as index and the three－factor and three－level experimentwas conducted by Box－Behnke experiment design method.The optimization process of extracts of Chinese Torreya aril by supercritical CO2extraction was particle size of 40 mush，extraction time of 20min，dynamic time of 2.5 h，temperature of 45℃ and pressure of 34 MPa.The optimal yield（22.12±0.09%）was obtained at the operating conditions.The results of GC－MS analysis showed that the main complements of aril extractswere diterpenoids，fatty acid，followed by sesquiterpenoids and monoterpenoids.

supercritical CO2extraction，Chinese torreya aril，response surfacemethod，gas chromatographmass spectrometer

TS229

A

1003－0174（2015）06－0067－07

宁波市重大（重点）科技攻关计划（2012C10015）

2014－01－13

于勇杰，男，1990年出生，硕士，食品工程

倪穗，女，1965年出生，教授，植物生物技术