ACE抑制肽构效关系的研究进展及乳源性ACE抑制肽的加工利用现状

沈小璐，吴兰芳，2，郭善广，范萌萌，程伟伟，蒋爱民

（1.华南农业大学食品学院，广州510642；2.河北中医学院，石家庄050200）

0 引言

近年来，生物活性肽已成为食品和医药领域的研究热点。这类肽大多相对分子质量较小，在人体内消化吸收较蛋白质容易。不仅能提供人体生长发育所需要的营养，还能调节人体生理机能，起到预防、甚至治疗疾病的作用[1]。目前发现的生物活性肽中所具有的功能包括降血压、降脂、抗菌等。本文主要讨论具有降压效果的血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽[2]。

食物蛋白来源的ACE抑制肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质获得，食用安全性高，对高血压患者可以起到降压作用而对血压正常者无降压作用，同时还具有免疫调节、减肥等功能，有着合成化学药物不可比拟的优越性[3]。因此有必要对食物来源的ACE抑制肽进行深入的研究，以期更好的获得和人工合成优良的ACE抑制肽。

1 ACE抑制肽的作用机制

1.1 ACE简介

血管紧张素转换酶(Angiotensin Convert Enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)，是含Zn2+辅基的二肽羧肽酶，属于二价金属酶一族，需由Zn2+和Cl－激活，相对分子质量为120～150 ku。在哺乳动物中，这种锌相关的金属酶参与血压的升降。ACE固定于细胞膜表面，可表现为两种形式，一种是体细胞形式（成年人ACE由1277个氨基酸分子组成）存在于内皮、上皮和神经元细胞中，另一种是较小的雄性生殖细胞形式。ACE是多功能酶，存在于体内肾素-血管紧张素系统(renin-angiotension systemun，RAS）和激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system,KKS)中[4]。

1.2 ACE抑制肽的降压机制

正常人体内的血压受很多因素调节，其中最重要的调节系统是RAS和KKS，前者是升压调节系统，后者是降压调节系统，对血压的调节起着重要的作用，调节过程如图1所示。

图1 ACE在血压调节中的作用

ACE是RAS中起重要作用的酶，它通过作用于该系统的中血管紧张素Ⅰ，使其脱去C末端两个氨基酸(His-Leu)而转变成为血管紧张素Ⅱ，血管紧张素Ⅱ是RAS中已知活性最强的血管收缩剂，它能作用于小动脉，使血管平滑肌收缩，迅速引起升压效应；同时还能刺激醛固酮分泌和直接对肠胃作用(减少肾血流量及促进Na+、K+的重吸收)，引起钠贮量和血容量的增加，也能使血压升高。另一方面，ACE也能作用于KKS降血压系统中的缓激肽，缓激肽是降血压物质，ACE催化从缓激肽C末端脱去两个氨基酸残基而使其失活，从而削弱缓激肽的降血压作用。如果抑制了ACE的活性，就能有效的防治高血压的发生。降血压肽能竞争性地抑制ACE的活性，从而阻断RAS的升血压作用，同时增强KKS的降压作用，起到降低高血压患者血压的作用[4]。

2 ACE抑制肽的来源

自1965年Ferreira首次从南美洲蝮蛇(Bothropsjararaca)的毒液中发现血管紧张素转化酶抑制剂后，蛇毒中存在降血压肽的研究引起了人们极大的兴趣。因而，毒蛇中ACE抑制肽的发现具有重大医疗价值，人们已在体内证实了毒蛇中ACE抑制肽能通过控制ACE活性达到预防与治疗肾依赖型高血压的效果[5]。

从食物来源上来看，ACE抑制肽主要来源于乳蛋白，动、植物蛋白和发酵食品。大豆、乳品和水产品是公认的优质蛋白源，且资源丰富，可作为提取ACE抑制肽原料，目前采用最多的是从牛奶蛋白中提取ACE抑制肽[3]。

3 ACE抑制肽的结构鉴定及构效关系

3.1 ACE抑制肽的活性与分子大小有密切关系

通常认为，肽分子量越小，其ACE抑制活性越高。代永刚等[6]人经过超滤分离，制备的ACE抑制肽活性及IC50都有显著提高。小于4 ku超滤液的ACE抑制活性比4～10 ku超滤液提高了13.22%，比原酶解液提高了17.63%。半抑制浓度比原酶解液提高了42.08%。Segura－Campos等[7]用豇豆分离蛋白酶解获得ACE抑制肽，然后用4种截留分子量的超滤膜进行超滤，并将ACE抑制活性最高的多肽段进行凝胶过滤和RP－HPLC纯化，结果表明相对分子质量＜1 ku的多肽段具有最高的ACE抑制活性。Ryan等[8]在研究肽氨基酸序列结构特点的时也可以看出大部分小分子的肽ACE抑制活性普遍高于大分子多肽。Fu-Yuan CHENG等[9]人在研究鸡骨蛋白时也表明有水解物表现出的强的ACE抑制活性与那些小肽有关。但是，它们的关系也并非绝对，例如，二肽Try－Lys的分子量为300 u，其 IC50为1.63 μmol/L，而11 肽Met－Ile－Phe－Pro－Gly－Ala－Gly－Gly－Pro－Glu－Leu 分子量为1.3 ku，其 IC50为28.7 μg/mL，两者均具有较强的ACE抑制活性[2]。

3.2 ACE抑制肽的活性与氨基酸序列结构

目前，对于ACE抑制肽的构效关系还没有完全研究透，但是很多的研究结果已有报到。国内外学者普遍认为，ACE抑制肽活性与其自身特性有关。体细胞ACE（somaticACE，sACE）的C端催化部位包括三个子催化位点见图2：S’、S1’和S2’，这三个位点分别与血管紧张素ⅠC-末端的三个疏水性残基Phe-His-Leu相对应。

图2 ACE结构

研究发现C端氨基酸与ACE抑制肽的抑制活性有重要关系，C端为芳香族氨基酸和脯氨酸时其抑制活性较高[3]。

Ryan[8]等研究发现在倒数第二的位置，脂肪族（V，I，A），碱性（R）和芳香族（Y和F）氨基酸残基是首选，而芳香族（W，Y和F）、脯氨酸（P）和脂肪族（A，L和M）残基在肽C-末端的最终位置出现频率较多。而且，C端残基上带正电荷的氨基酸，如赖氨酸（ε-氨基）和精氨酸（胍基），可以显著提高降压肽的抑制活性。贾俊强等[10]通过收集270种降压肽的氨基酸组成进行分析，结果疏水氨基酸和非疏水氨基酸在降血压肽的N端出现的频率相比仅多了6.6%，说明疏水氨基酸并不是降血压肽的N端必须要有的氨基酸,而是随机出现在降血压肽的N端。与降血压肽的N端氨基酸特征相比，其C端氨基酸特征对降血压活性影响更为重要。Cheung等[11]研究也认为ACE抑制肽的活性主要取决于C－端氨基酸，C－端氨基酸为芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)和脯氨酸时其抑制活性较高。

此外，段秀等[3]表明对于大于3个氨基酸长度的多肽，羟脯氨酸（Hyp）的存在是肽与ACE催化位点结合的关键。而且，肽的整体疏水性很重要，亲水性肽具有弱的或没有ACE抑制活性，因为亲水性肽与ACE的活性部位是不相容的。事实上，ACE抑制作用是通过疏水性多肽与ACE子催化位点的高亲和力来实现的。ACE抑制肽的作用不仅仅与C端三个氨基酸残基有关，切割位点的N端残基可能与ACE的关键子催化点相互作用。

3.3 ACE抑制肽的活性与氨基酸之间的构象

短肽的生物活性除了与一级结构氨基酸数量、种类和序列有关系之外，也与其构象存在关系，但目前对于ACE抑制肽高级结构与活性的关系研究尚不深入。

王强等[12]在花生ACE抑制肽的研究中采用固相合成方法合成了具有相同氨基酸序列的短肽，并对合成肽活性进行测定。实验证实此种氨基酸序列的短肽具有明显的体外ACE抑制活性，且合成短肽的活性高于花生蛋白源短肽KLYMRP。得出原因可能是ACE抑制肽各氨基酸之间可形成多种不同构象，肽链的空间构象与其功能活性也存在一定的相关性[13]。他们通过量子化学理论对ACE抑制肽的活性部位进行了推测，初步探讨了其ACE抑制活性与构象的关系。通过短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro(KLYMRP)的构象优化、短肽KLYMRP与ACE之间的相互作用分析表明，短肽KLYMRP与ACE活性位点的残基形成5个氢键，一个Pi-Cation相互作用，并与锌离子形成配位键，这些作用力共同稳定了短肽-ACE复合物的构象，从而有利于ACE抑制活性的发挥。

4 ACE抑制肽的定量构效关系（QSAR）

目前国内外ACE抑制肽的研究多集中于肽的制备、纯化、序列测定、体内/外活性评价等方面，对ACE抑制肽的构效关系研究也有一定进展，但大多是一些定性描述。一般认为ACE抑制肽C末端结构对其竞争性结合于ACE上有着重要的影响，更倾向于C末端三肽的每个位置含有疏水性氨基酸。随着不同结构的ACE抑制肽不断从食物蛋白水解液中分离出来，学者们发现有许多活性极强的肽并不满足上述规律。因此，如何准确表征ACE抑制肽的结构，预测肽的活性，阐明其作用机理，并在此基础上进一步开发ACE抑制肽类药物已成为目前亟待解决的问题[14]。

定量构效关系(Quantitative Structure Activity Relationship，QSAR)作为一种定量描述活性物质结构与活性关系的有效手段，具有量效关系明确、信息丰富、对未知化合物活性预测能力强等优点。计算机辅助分子设计的方法为功能食品的开发和创新提供了一种新的手段[15]。由于ACE抑制肽是一类相对分子质量较小的短肽(一般低于1500)，对其结构的定量描述不会过于复杂，因此具有可行性。对ACE抑制肽进行QSAR研究将有助于深入理解肽的结构特征以及活性机理。

刘静等[16]收集20种天然氨基酸的457种理化性质，按照疏水、电性特征、氢键贡献和立体特征分类后，对它们分别进行主成分分析(Principal component analysis,PCA)，得到一个新的氨基酸残基结构描述符SVHEHS。采用PLS算法进行ACE抑制肽的QSAR建模研究，最后拟合出投影重要性指标图、主成分的得分分布散点图、肽到模型X空间中心规格化距离图、载荷贡献散点图、肽的实验值和预测值关系图等对样本肽进行结构描述。此描述符能用于ACE抑制肽的活性预测和分子设计，有利于ACE抑制肽的深入研究。

苏淅娜等[14]采用氨基酸描述符SVHEHS(Scores Vector of Hydrophobic，Electronic，Hydrogen bonds and Steric Properties)对各肽样本进行结构表征后，进行自交叉协方差(Auto Cross Covariances，ACC)处理，并分别利用多元线性回归(Multiple linearregression，MLR)[15]、偏最小二乘(Partial least square regression，PLS)、人工神经网络(Artificial neural networks，ANN)3种建模方法进行ACE抑制肽QSAR建模。结果发现：ANN与PLS模型的R2分别为0.958、0.862，Q2Loo分别为 0.948、0.829，Q2ext分别为 0.634、0.632，即ANN模型在拟合能力以及模型稳健性方面更好，但其外部预测能力与PLS模型相差不大；而MLR模型的 R2、Q2Loo、Q2ext均较小，建模效果相对较差[14]。最终模型能对不同长度、活性差异大的肽进行准确的活性预测。

5 乳源性ACE抑制肽的加工利用

高血压是我国主要的常见疾病之一，且呈数量逐渐上升、人群年轻化的趋势，ACE抑制剂药物在治疗高血压的过程中得到了公众的认可，但由于其对肾脏的毒副作用及对其他的一些副作用迫使人们寻找更加安全高效的ACE抑制剂，而从天然食物中分离到的ACE抑制肽正好符合这一特点[17]。

高血压的治疗应从预防开始，ACE抑制肽可作为保健食品平时服用。现阶段，大部分的ACE抑制肽来自天然动植物蛋白，提取方法多采用酶解，较为安全，这类食品人们的接受程度也较高。目前，日本是研究降压肽最为深入的国家，酸奶饮品中添加降血压肽作为保健饮品已在日本上市，形成了较为成熟的产业链[2]。

5.1 加工利用

乳及乳制品含有最丰富的动物蛋白质。研究表明，其不仅能给人提供丰富的营养，而且还是许多生物活性肽的重要来源，其中最具有开发和应用价值的是ACE抑制肽。自Maruyama等[18]于1982年从酪蛋白水解物中分离出具有ACE抑制活性的12肽(CEJ12)以来，各国研究人员采用不同的方法陆续从酪蛋白中分离提取出了更多的ACE抑制肽。乳及乳制品来源的抗高血压活性肽成为乳品研究领域的新热点，现已在乳酪蛋白、乳清蛋白、发酵乳等[19-22]中发现了许多抗高血压活性肽。HARTMANN R等[23]的研究总结也说明了目前国外以乳源蛋白为原料的降血压产品越来越多。

1995年，Nakamura等人[24,25]用Lactobacillus helveti-cus和Saccharomyces cerevisiae作为发酵剂制作了一种名为Calpis的酸乳饮料。实验得出，随着发酵时间的增长，牛奶的ACE抑制活性增加；SHR长期服用Calpis后，可抑制血压上升。王世宾等[26]通过对Evolus高钙发酵乳（采用特殊菌种－瑞士乳杆菌发酵，）的研究表明：经严格科学的工艺控制，得到高含量的降血压短肽，可以起到降低血压的作用。Evolus高钙发酵乳与其他某些产品其降血压优越性更强，并且自身对人体收缩和舒张压有明显的降压效果。除此之外，BLANCA H L等人[27-29]也研究制备了一些乳源降压肽降压产品并且验证了它们在临床上的效果。

5.2 展望

通过对ACE抑制肽不断深入的研究，更有利于掌握ACE抑制肽的结构功能的关系，从而更好的为有效提取，更重要的为是人工合成服务。

我国有着丰富动植物蛋白资源，而且食品加工产生下脚料也可作为其原料来源[7]。乳源性ACE抑制肽的应用只是其中的一小部分，如何合理利用好现有的资源加工制备高活性ACE抑制肽将是今后的主要研究方向之一。ACE抑制肽的研究目前还处于起步阶段，所以有着巨大的潜在市场和广阔的发展前景。

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