气相色谱法测定酸奶中8种有机磷农药的残留

徐迪，王欢，耿文静，杨蕾蕾，卜繁玲，李原野，张英华

（东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

0 引言

酸奶是比较适合人体营养需要的一种乳制品，但随着农药大量使用，酸奶的原料乳中农药残留可能进入食物链对人类健康产生威胁[1]，如有些有机磷农药进入生物体影响神经中枢系统[2]。经有关研究确认加工处理可为食品安全提供保障[3]。因此乳制品中农药污染问题应得到重视。

目前有气相色谱（GC），高效液相色谱（HPLC）[4]，气相色谱-质谱联用（GC-MS）[5]，液相色谱-质谱联用（LC-MS）[6]等农药残留分析技术。本文采用GC测定有机磷农药残留，目前有机磷农药残留GC检测应用在粮食、蔬果较广泛，而应用在酸奶等乳制品还很少。所以本文针对酸奶这样复杂基质中的有机磷农药残留进行检测分析，优化处理方法及色谱条件使其更好地应用到酸奶等乳制品的检测。

1 实验

1.1 试剂及仪器设备

脱脂乳粉。有机磷农药标准品：二嗪磷、久效磷、乐果、甲基对硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、杀螟硫磷。色谱级丙酮、氯甲烷、乙腈、丙酮、无水硫酸钠等为国产分析纯药品。

气相色谱仪Agilent7890配火焰光度检测器，色谱柱：DB1701；高速离心机LG10-2.4A；氮吹仪MTN-2800D。

1.2 色谱条件

DB-1701色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；进样口温度200℃，FPD检测器250℃。程序升温：初始温度90℃(保持1 min)，以15℃/min升至260℃(保持3 min)；载气(N2)流速10 mL/min。

载气为高纯氮气，纯度≥99.999%，流速10 mL/min；燃气为氢气，纯度≥99.999%，流速75 mL/min；助燃气为空气，流速100 mL/min。

进样方式为不分流进样。进样体积1.0 μL，以保留时间定性，峰面积定量。

1.3 酸奶样品的处理[7]

称取10.0 g酸奶样品于50 mL离心管中，加入10 mL提取液(丙酮∶乙腈=1∶4)，浸泡0.5 h然后将其离心6 000 g离心6 min上清液收集于150 mL分液漏斗中，离心管再加入10 mL提取液，重复提取1次，合并上清液于分液漏斗中。分液漏斗中分别加入25 mL和10 mL二氯甲烷剧烈振摇2次，每次振摇10 min，静置、分层，将二氯甲烷相收集50 mL容量瓶中，加入3.0 g无水硫酸钠除去水；过滤，取5mL提取液用氮吹仪吹至近干，用色谱纯丙酮定容到1.0 mL，0.45 μm有机滤膜过滤，气相色谱仪测定，外标法定量。试验重复3次。

1.4 计算

气相测定结果为

式中：X为样品中农药的质量分数(mg/kg)；C为标准溶液中农药质量浓度(mg/L)；m为样品质量(g)；V为提取溶剂的总体积(mL)；M2为吸取出用于检测的提取溶液的质量(g)；M1为样品最后的质量(g)；S1为样品中被测农药峰面积；S0为农药标准溶液中被测农药的峰面积。

检测限计算公式为

式中：DL为检出限（mg/kg）；N为基线噪声；C为样品质量分数(mg/kg)；h为样品峰高。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的分析

因有机磷农药结构、极性、熔沸点等存在差异，故色谱条件的选择直接影响不同种类农药的色谱分离效果。而色谱柱的选择是整个色谱条件优化的重要环节，实验初步选用弱性的HP-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)和中极性的DB-1701毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm)，但是HP-5毛细管柱经过反复实验，很难使毒死蜱和对硫磷分开，而DB-1701毛细管柱把8种农药得到很好分离。关于有机磷多残留分析的方法的文献很多，多采用FPD[8-10]，有采用NPD[11-12]，在现有气相色谱仪Agilent7890，FPD检测器的条件下，进行色谱条件的优化。

进样口温度的选择，一般要接近样品中沸点最高组分的沸点，但要低于易分解组分的分解温度，检测器温度的设置原则是保证流出色谱柱的组分不会冷凝，同时满足检测器灵敏度的要求，色谱柱温度的确定主要由样品的复杂程度和汽化温度决定，原则是既要保证待测物的完全分离，又要保证所有组分能流出色谱柱，并且分析时间越短越好，根据以上原则本试验进行多次分离试验后，确定进样口温度200℃，检测器温度250℃，色谱柱温度90℃，在该条件下8种农药分离良好，基线平稳，检测器灵敏度高，分析时间在14 min内，8种农药的气象色谱图如图1所示。本研究是在酸奶体系中进行检测有机磷农药的残留情况，如图2所示，8种农药残留达到有效的分离程度，并且样品中无明显的杂质峰出现。

图1 8种有机磷农药标准品色谱

图2 酸奶样品中8种有机磷农残色谱

图1和图2中，1为二嗪磷；2为久效磷；3为乐果；4为甲基对硫磷；5为毒死蜱；6为马拉硫磷；7为杀螟硫磷；8为对硫磷。

2.2 标准曲线的制作

以标准样品的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，获得8种有机磷农药的标准曲线。

图3 8种有机磷农药的标准曲线

由图3可以看出，8种有机磷农药的标准曲线呈现良好的线性关系，可以得知标准曲线的回归方程及相关系数。通过检测限计算公式可以计算出样品的检出限0.005～0.019 mg/kg的范围之内，结果如表1所示.

表1 8有机磷农药残留的回归方程、保留时间、相关系数及检出限

该实验检测的各种农药质量分数值与响应峰面积值之间的线性关系，除久效磷的线性关系稍微偏小0.9981外，其它农药的线性关系均达到0.999以上，完全满足实验要求，一定程度上验证了该方法的准确性及应用性。由表1可知，8种农药无论从分离效果还是峰型上都非常好，说明该方法能够有效的将8种有机磷农药进行分离。

2.3 样品加标回收率测定

取10.0 g空白奶样，分别添加8种有机磷农药标准液，使其在样品中的质量分数分别为0.25，0.50和1.00 mg/kg的3个添加水平，每个水平重复3次，得到的回收率和标准偏差的测定结果如表2所示。

表2 酸奶中8种农药的添加回收实验测定结果

由表2可以看出，8种农药的回收率范围分别为89.78%～92.99%，84.51%～94.70%，86.21%～95.88%，86.21%～92.87%，88.27%～93.91%，86.38%～105.96%，88.51%～96.64，88.20%～109.55%，平均回收率均在84%以上。结果表明，该方法具有较高的精密度和准确度，可用作这8种农药残留的定量分析。

3 讨论

3.1 提取试剂的选择

基于酸奶这种复杂体系进行研究的，由于原料乳中有大量的蛋白质，所以在提取剂的选择和萃取的时间及萃取的力度方面存在着挑战性。徐路妹[13]比较了乙腈，乙酸乙酯和丙酮做萃取剂时农药残留的提取效果，发现乙腈效果最好。张贵群[14]也认为乙腈提取效果最好，但由于乙腈毒性及价格的关系所以在试验中建议用丙酮-水而未采用乙腈。而该实验酸奶中农残检验要求高，原料乳中的蛋白质还易引起乳化现象，很难分层，使回收率大大降低，所以经过反复实验，调整各提取试剂的比例，最终确定丙酮、乙腈（1∶4）和二氯甲烷。可以同时提取多种有机磷农药，且提取效果好、操作简单，仍是一种首选的萃取试剂。

3.2 样品处理简单，无乳化现象

样品前处理不需要过柱的步骤，只需用0.45 μm的有机相滤膜过滤来进行净化处理，大缩短了分析时间，并且净化彻底，色谱图中没有出现杂质峰。一般萃取含有蛋白和脂肪的物质时会引起乳化现象，本实验最终注意以下几点后，样品在萃取时无乳化的现象。首先离心一定要使上清液澄清透明，不含有蛋白质，其次提取液的比例要适当，每次在萃取振摇时在单位时间里频率一样力度要适当，力度过大也会引起乳化，如果以上方法还会出现乳化就加入少量的饱和食盐水。

3.3 检出限、回收率符合检测要求

本实验研究农药的检出限、回收率、标准偏差等参数都符合检测要求，能够应用此方法对酸奶等乳制品进行农残监控。

4 结 论

研究结果表明：气相色谱仪Agilent7890，FPD检测器，进样口温度200℃，检测器温度250℃，色谱柱温度90℃；丙酮、乙腈（1∶4）和二氯甲烷萃取，8种有机磷农药（二嗪磷，久效磷，乐果，甲基对硫磷，毒死蜱，马拉硫磷，杀螟硫磷，对硫磷）以0.25，0.50，1.00 mg/kg三个添加水平时的检出限在0.005～0.019 mg/kg的范围内，平均回收率84.51%～109.55%，标准偏差＜4%，该方法快速、灵敏度高、选择性好，各项技术指标满足酸奶体系中8种有机磷农药残留检测要求。

[1]WINTERINGHAF P W.Mechanisms of Selective Insecticidal Action[J].Annual Review of Entomology,1969,14(1):409-442.

[2]ZHANG Z,HONG Q,XU J,et al.Isolation of Fenitrothion-degrading Strain Burkholderia sp.FDS-1 and Cloning of Mpd Gene[J].Biodegradation,2006,17(3):275-283.

[3]KAUSHIK G,SATYA S,NAIK S N.Food Processing a Tool to Pesticide Residue Dissipation A review[J].Food Research International,2009,42(1):26-40.

[4]HEIDARIH R.Multi-response Optimization of Magnetic Solid Phase Extraction Based on Carbon Coated Fe3O4 Nanoparticles Using Desirability Function Approach For The Determination of The Organophosphorus Pesticides in Aquatic Samples by HPLC UV[J].Talanta,2012,99:13-21.

[5]LIU Q,KONG W,QIU F,et al.One-step Extraction for Gas Chromatography With Flame Photometric Detection of 18 Organophosphorus Pesticides in Chinese Medicine Health Wines[J].Journal of Chromatography B,2012,885:90-96.

[6]XU Z L,et al.Monitoring of Organophosphorus Pesticides inVegeta⁃bles Using Monoclonal Antibody-based Direct Competitive ELISA FollowedbyHPLC MS/MS[J].?FoodChemistry.2012,131(4):1569-1576.

[7]王晶,赵新淮.培养基中3株乳酸菌对7种有机磷农药的降解作用[J].中国乳品工业,2011,39(6):37-39.

[8]FERRER I,THURMANE M.Multi-residue Method for the Analy⁃sis of 101 Pesticides and Their Degradates in Food and Water Samples by Liquid Chromatography/time-of-flight Mass Spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2007,1175(1):24-37.

[9]HU C,HE M,CHEN B,et al.A Sol gel Polydimethylsiloxane/Poly⁃thiophene Coated Stir Bar Sorptive Extraction Combined with Gas Chromatography-flame Photometric Detection for the Determination of Organophosphorus Pesticides in Environmental Water Samples[J].Journal of Chromatography A,2013,1275:25-31.

[10]SAMDI S,SERESHTIH,ASSADI Y.Ultra-preconcentration and Determination of Thirteen Organophosphorus Pesticides in Water Samples Using Solid-phase Extraction Followed by Dispersive Liquid-liquid Microextraction and Gas Chromatography with Flame Pho⁃tometric Detection[J].Journal of Chromatography A,2012,1219:61-65.

[11]RASTRELIL,TOTAROK,DE S F.Determination of Organophos⁃phorus Pesticide Residues in Cilento(Campania,Italy)Virgin Olive Oil by Capillary Gas Chromatography[J].Food Chemistry,2002,79(3):303-305.

[12]GONZALEA C Á,HERNANDEZ B J,BORGES M T M,et al.Determination of Organophosphorus Pesticides and Metabolites in Cereal-based Baby Foods and Wheat Flour by Means of Ultra⁃sound-assisted Extraction and Hollow-fiber Liquid-phase Microex⁃traction Prior to Gas Chromatography with Nitrogen Phosphorus Detection[J].Journal of Chromatography A,2013,1313:166-174.

[13]徐陆妹,楼冰冰.蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测方法研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(5):852-853.

[14]张贵群,聂思桥,龙丽萍,等.气相色谱法分析甘蓝及其土壤中的烯啶虫胺残留[J].色谱,2010,28(11):1103-1106.