三水杨醛三乙基四胺合锌金属配合物的合成及其与牛血清蛋白作用研究

周成勇，杨慧琴，王冰冰,曹天龙

（长治学院 化学系，山西 长治 046011）

三水杨醛三乙基四胺合锌金属配合物的合成及其与牛血清蛋白作用研究

周成勇，杨慧琴，王冰冰,曹天龙

（长治学院 化学系，山西 长治 046011）

以水杨醛和三乙基四胺反应合成三水杨醛三乙基四胺配体，并得到了配体的晶体结构，将配体与ZnSO4·7H2O作用合成了新的三水杨醛三乙基四胺合锌金属配合物。通过测定其熔点、电导率、红外谱图和紫外谱图，对金属配合物的结构进行了初步表征。利用荧光光谱法对所合成的锌金属配合物与牛血清蛋白的相互作用进行了研究，结果表明该金属配合物可使牛血清蛋白的荧光发生猝灭，在0-3.36×10-5mol/L浓度范围内的猝灭方式为静态猝灭。

水杨醛；三乙基四胺；锌金属配合物；牛血清蛋白

1 引言

Schiff base是一类非常重要的有机化合物，在与各种羰基化合物和不同的胺类反应时，具有灵活的选择性，可以得到结构复杂、种类繁多的各种有机配体，比如手性配体与非手性配体，链状配体与环状配体，多齿配体与单齿配体等。Schiff base上的基团-C=N-本身所具有的特性以及其它取代基团所具有的灵活多变性，使其具有一定的药理学和生理学活性，在药物化学和生物学上的应用非常广泛，主要用于治疗、合成、生化反应等方面[1-4]。同时又因为其结构中-C=N-基团氮原子的杂化轨道上存在孤电子对，因此Schiff base又具有很好的配位能力，可与多种金属化合物生成配合物，且其金属配合物具有良好的生物活性[5-7]。自从20世纪60年代Schiff通过羰基化合物和一级胺反应首次合成席夫碱（Schiff base）以来，已经有很多文献报道了有关Schiff base方面的研究[8-12]，其中Yamada报道含有Schiff碱双键（-C=N-）的有机化合物具有一定的抗癌活性[13]。Schiff base及其金属配合物的合成一直是实验研究的热点，目前对Schiff base配合物的开发主要集中在合成低毒、高效、性能优越的金属配合物以及一类具有生理功能的席夫碱配合物和具有灵活多变性的金属配合物。

锌离子是人体内第二丰富的过渡金属元素，在人体内的总量可达到2-3克，是诸多含锌酶的活性催化中心和结构因子。作为金属蛋白酶的结构因子和转录因子，可以和诸多调控酶相互作用，作为第二信使触发或阻断诸如细胞凋亡等重要生理过程[14]。同时，锌离子在许多生理过程中发挥着重要作用，如脑功能、基因表达、生殖等，如果破坏Zn2+在人体内的平衡，将会导致一系列的疾病[15-19]。锌元素在人体中的主要作用如下：（1）可以影响人体的生长发育。尤其是处于生长期的儿童、青少年如果缺少锌元素，会导致发育不良，严重缺乏时，可能会影响智力发育和出现侏儒症等现象。（2）保持人体正常饮食状况。缺乏锌元素可能会导致厌食、偏食等现象。（3）可以提高人体免疫力。在免疫器官胸腺发育中，锌元素是营养素，当锌元素充足时才可以保证胸腺的正常发育，当正常发育时，分化的T淋巴细胞，可以增强细胞免疫功能。（4）对伤口的愈合有好处。目前临床主要应用于治疗皮肤病方面。（5）对维生素A的代谢与视觉有很大影响。在临床上锌元素主要表现为对眼睛有诸多益处，这是因为锌元素可以促进维生素A的吸收。维生素A一般储存在肝脏中，在人体需要时，靠锌来完成“动员”工作，从而将维生素A输送到血液中。（6）可以维持男性正常的生精功能。男性睾丸中存在有大量的锌元素，在参与精子的整个生成、成熟和获能的过程中，锌元素起到了重要的作用。当男性一旦缺乏锌元素时，就会出现精子数量少、活力下降、精液液化不良等现象，最终可能导致男性不育。同时蛋白质是构成生命的重要物质，是生命的物质基础，如在生物体内发挥着重要功能的酶、抗体、转运蛋白等。血清蛋白主要存在于血液中，维持着血浆的胶体渗透压，在人体中可以和许多微溶于水的物质结合，使其转化为易溶于水的复合物。

水杨醛类席夫碱的金属配合物的合成方法比较简单，应用广泛，机关研究者已对其做了很多的研究，但大多集中在与DNA方面的作用，在Schiff base金属配合物与蛋白作用方面的研究却鲜有报道。因此文章以水杨醛和三乙基四胺反应合成三水杨醛三乙基四胺配体，并得到了配体的晶体结构，将配体与ZnSO4·7H2O作用合成了新的三水杨醛三乙基四胺合锌金属配合物。并通过测定其金属配合物的熔点，电导率、红外谱图、紫外谱图，对金属配合物的结构进行了初步表征。然后利用荧光光谱法研究了所合成的锌金属配合物与牛血清蛋白（bovine serum albumin，简称BSA）的相互作用，为其在分子生物学与化学生物学以及药物化学方面的应用和研究以及新型药物的研发等方面提供有价值的信息。

2 配合物的合成路线

图1 配合物合成路线Fig.1 The synthetic route of the complex

3 实验部分

3.1 主要试剂和仪器

主要试剂

主要仪器

3.2 配体的合成

搅拌下，将3 mL（0.02 mol）三乙基四胺溶于20 mL无水乙醇的溶液逐滴加入到15 mL（0.10 mol）水杨醛中，约30 min。反应液由橙黄色慢慢变为黄色，且有沉淀析出，继续搅拌3 h，停止反应，静置、抽滤，洗涤，得到黄色固体。用无水乙醇重结晶，抽滤，洗涤，干燥，得黄色的固体粉末7.4827 g，产率81.6%，熔点为108.0-108.9℃。

3.3 配合物的合成

恒温（50℃）搅拌下，将溶于30 mL无水乙醇的0.2948 g（0.0010 mol）ZnSO4·7H2O的无色透明溶液逐滴加入至溶于60 mL无水乙醇的0.4879 g（0.0010 mol）配体的黄色溶液中，约需20 min，继续搅拌回流3 h，冷却得黄色针状晶体，抽滤，洗涤，重结晶得到黄色固体0.5412 g，产率为87.3%，熔点为163.9-165.5℃。

3.4 牛血清蛋白溶液的配置

根据文献[20]制备牛血清蛋白溶液（1×10-4g/mL）：加0.0100 g的牛血清蛋白于10 mg水中（为减少变性，需将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），充分溶解，定容至100 mL，于-20℃贮存。

3.5 配体及配合物的表征

3.5.1 配体的晶体结构测定

将合成的三水杨醛三乙基四胺黄色固体溶于无水乙醇得其饱和液，静止数日，培养出其单晶，测其晶体结构如图2。

图2 配体的晶体结构图Fig.2 The cystal structure of the ligand

3.5.2 熔点的测定

表1 熔点测定数据表Table 1 Determination of the melting point

3.5.3 电导率的测定

室温下，各物质电导率的测定数据见表2。

表2 电导率测定数据表Table 2 Determination of the conductivity

3.5.4 红外光谱测定

用KBr做载体压片，测定三水杨醛三乙基四胺配体及其配合物的红外光谱，见图3、图4及表3。

图3 配体的红外光谱图Fig.3 The IR spectral of the ligand

3.5.5 紫外可见吸收光谱

在25℃，取30 μL浓度为8.2928×10-4mol·L-1三水杨醛三乙基四胺的无水乙醇溶液和1970 μL的无水乙醇置于1 cm石英比色皿中，测定其吸光度，然后每次取浓度为7.5472×10-4mol·L-1的Zn2+溶液（ZnSO4·7H2O）10 μL加入到比色皿中并搅拌均匀，测定吸光度，紫外可见吸收光谱如图5。

图4 配合物的红外光谱图Fig.4 The IR spectral of the complex

表3 配体及配合物红外光谱分析（cm-1）Table 3 The IR spectral of the compounds

图5 配体与锌离子作用的紫外可见光谱

3.5.6 配合物荧光光谱测定

在激发波长282 nm、狭缝Ex=2.5 nm、Em=2.5 nm条件下，测定配体与金属离子络合的荧光现象。比色皿中先加入20 μL浓度为1.6151×10-3mol/L配体无水乙醇溶液，再加入1980 μL无水乙醇，测定其荧光光谱，然后向样品池中每次加入20 μL浓度为2.8650×10-4mol/L的ZnSO4·7H2O的水溶液进行荧光测定。荧光光谱如图6，配体与金属离子物质量之比见表4，图7为荧光强度随金属离子和配体物质量之比的变化图。

表4 荧光光谱测定Table 4 the fluorescence measurement

3.6 配合物与牛血清蛋白的作用

取20 μL牛血清蛋白溶液（浓度1×10-4g/mL）溶于1980 μL无水乙醇溶剂，测定其荧光光谱，然后每次加入20 μL浓度为5.1066×10-4mol/L的金属配合物的水溶液，分别测定其荧光光谱。

激发Ex WL:280.0 nm，Ex Slit:2.5 nm，发射Em Slit:2.5 nm，PMT Voltage:800 V。荧光光谱见图8。

图6 金属离子加入对配体荧光的影响Fig.6 Fluorescence emission spectra(excited at 282 nm) of Zn2+in the absence(1)and presence(2-8)of increasing concentrations of the metal ion.

图7 荧光强度随金属离子和配体物质量之比的变化图Fig.7 Fluorescence emission spectra(excited at 282 nm) of complex at 445 nm changed with the two parts's proportion of amount of substance

图8 配合物与牛血清蛋白作用的荧光光谱Fig.8 Fluorescence emission spectra(excited at 280 nm) of BSA with the coordination

为了进一步阐明其荧光猝灭机制，分别作出18℃和28℃时BSA猝灭的荧光光谱，根据Stern-Volmer方程[22,23]

式中F0和F分别为加入金属配合物前后所测得的荧光强度值，τ0为没有猝灭物质存在时荧光分子的平均寿命。Kq为双分子碰撞猝灭常数，[Q]为猝灭物质的浓度，KSV为Stern-Volmer猝灭常数，且有KSV=Kqτ0。绘制F0/F对[Q]关系图，见图9。

图9 不同温度下金属配合物对牛血清蛋白荧光淬灭的Stern-Volmer曲线Fig.9 Stern-Volmer curve of BSA with the complex at 18℃and 28℃

4 结果与讨论

4.1 配体晶体结构的测定

从配体的晶体结构（见图2）可以明显看出配体三水杨醛三乙基四胺已经被合成。

4.2 熔点的测定

从表1的数据可以看出，配体的熔点为108.0-108.9℃，配合物的熔点为163.9-165.5℃，由此可初步判断这两种固体都较为纯净，且配合物的熔点明显高于配体的熔点，也可初步得出有配合物生成。

4.3 电导率的测定

从表2中可以看出，水和乙醇混合溶剂的平均电导率为0.087 S·cm2·mol-1，锌离子溶液的摩尔电导率是122.778 S·m2·mol-1，金属配合物的摩尔电导率是121.876 S·m2·mol-1，由此可知，金属的摩尔电导率与ZnSO4·7H2O的.摩尔电导率非常相近，可初步推测该配合物为离子型配合物[24]。

4.4 红外光谱分析

从图3和图4中可以看出，配体和配合物中的O-H和N-H键IR吸收峰重合，且在配体中其伸缩振动吸收峰为3448 cm-1，而在配合物其伸缩振动吸收峰为3433 cm-1，向低频方向移动了15 cm-1。这是由于氧原子和氮原子与金属离子形成配位键后，导致其原子上的电子云密度降低，使得O-H和N-H键中的成键电子更偏向于配位原子，从而导致O-H和N-H共价键的键强度降低，因此向低频方向移动。同理，配体中C-N键的伸缩振动吸收峰为1055 cm-1，而配合物中C-N键的伸缩振动吸收峰为1050 cm-1，向低频方向移动了5 cm-1；配体中C=N键的伸缩振动吸收峰为1630 cm-1，而配合物中C=N键的伸缩振动吸收峰为1625 cm-1，也向低频方向移动了5 cm-1，因此可以确定配合物的形成。同时，在配体和配合物中都可以明显看出O-H键的存在，这说明形成配合物后，仅仅是氧原子上的孤对电子与金属离子形成配位键，而酚羟基并未发生电离，进一步证明了该金属配合物为离子型配合物。

4.5 紫外可见吸收光谱

图5中有五个等吸收点，分别位于248 nm、261 nm、282 nm、331 nm、405 nm处，这表明配体和Zn2+生成了稳定的化合物[25]。当Zn2+加到2.2642× 10-3mol时，366 nm处的吸收峰不再明显变化，说明三乙基四胺配体与Zn2+有确定的结合比。

4.6 荧光光谱法分析

从图6中观察波长为428 nm的荧光强度可知，加入锌离子的无水乙醇溶液后，荧光强度逐渐减弱（图6中2～6线）；当加入的金属离子与配体的物质的量之比为1:1时，荧光强度达到最小；再加入金属离子，荧光强度基本不再下降（图6中6～8线）。另外从表4和图7中也可以明显看出金属离子与配体以1:1的比例形成配合物。

4.7 配合物与牛血清蛋白的作用

由图8可看出，随着金属配合物的加入，在约343 nm处蛋白质发生典型的荧光猝灭，说明金属配合物与蛋白质发生了作用。荧光猝灭通常可分为动态猝灭和静态猝灭。一般情况下，可依据不同温度下的猝灭结果区别动态与静态猝灭：对于动态猝灭，随着温度的升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度升高而增大；若是静态猝灭则温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小[26]。由图9可看出，随着温度的升高，荧光物质的猝灭常数变小，故可判定配合物在0-3.36×10-5mol/L浓度范围内的作用方式为静态猝灭。

5 结论

综上所述，文章利用水杨醛，三乙基四胺和ZnSO4·7H2O合成了三水杨醛三乙基四胺合锌金属配合物，并通过熔点的测定、电导率法、红外光谱法以及紫外可见吸收光谱法对合成的金属配合物结构进行初步表征。结果表明金属Zn2+离子与配体1:1的比例形成离子型配合物。利用荧光光谱法对所合成的金属配合物与BSA的作用模式进行了研究，结果表明该金属配合物与BSA的作用模式为静态猝灭。

另外尚需利用元素分析、1H NMR、13C NMR以及X-射线衍射等方法对所合成的金属配合物结构进行进一步表征。测定其准确结构后，还可通过凝胶电泳法测定该金属配合物是否具有与蛋白质作用的活性，并进一步推断出其作用机理，其研究结果可为该金属配合物在化学生物学和分子生物学方面的应用以及新型药物的开发提供有价值的信息。同时研究分子与蛋白质的相互作用及其对蛋白质结构的影响，不仅对全面阐明小分子化合物与蛋白质的结合机制有重要意义，同时也对阐明药物在体内的运转、分配及代谢过程也具有重要意义。

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Zhou Cheng-yong,Yang Hui-qin,Wang Bing-bing，Cao Tian-long
（Department of Chemistry,Changzhi University,Changzhi Shanxi,046011）

（责任编辑 王璟琳）

062

A

1673-2015（2015）05-0001-08

国家级大学生创新创业项目（201510122003；201410122004），山西省大学生创新创业项目（2015428;2014429）。

2015—07-25

周成勇（1963—）男，河南沁阳人，教授，博士，主要从事有机合成及化学生物学方面的研究。