黑果花楸果实多酚提取工艺的研究

杨苑艺，李晶莹，吴佳琳，高玉梅，杜春艳

(1．东北林业大学林学院，哈尔滨150040;2．黑龙江省牡丹江市林业局，黑龙江牡丹江157011)

黑果花楸(Aornial mealnocarpa)为蔷薇科(Roseeeae)腺肋花楸属的多年生落叶灌木。原产自美国东北部，后来被我国引进［1］。树高1．5～2．5 m，树皮光滑，一株树木的枝条多达50条以上，多年生枝条灰褐色，新梢淡褐色［2］。根部发达，主根分布于30～40 cm土层中。果实为紫黑色浆果，球形，甜酸略有微涩味［3］。姜镇荣等研究了辽西地区土壤酸碱性对黑果花楸生长的影响，发现土壤pH≥7．5时，选用硫酸亚铁、硫磺粉或硫酸钾等含硫的肥料可以改善土壤酸碱性［4］;高晔华等对黑果花楸组培苗增殖进行了初步研究，结果表明:MS为适合黑果腺肋花楸组培苗生长的基本培养基;激素处理为BA0．5 mg/L，NAA0．3 mg/L时植株生长健壮，鲜重、干重分别达到最大值，增殖系数达到8．0［5］;李梦莎等对超声提取黑果花楸花色苷工艺进行了优化，结果表明，最佳提取参数为乙醇体积分数80%，提取温度50℃，提取时间48 min，在此条件下黑果花楸果花色苷提取量为39．80 mg/g［6］。植物多酚(plant polyphenol)［7］是分子中具有多个羟基酚类植物成分的总称［8］，植物成分中多酚的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素［9］，主要存在于植物体的皮、根、叶、壳和果肉中［10］。研究表明植物多酚具有极强的抗氧化活性［11］，此外还具有抗心血管病、抗肿瘤、降血糖、抗老化和抗辐射等作用［12］。黑果花楸果实富含多酚，具有非凡的保健作用，在欧美地区已广泛应用于医药和功能食品工业，而国内还鲜有对其果实多酚的研究报道。

本研究以珠磨法从黑果花楸的果实中提取多酚，以期获得最佳的多酚提取工艺，为黑果花楸的开发利用提供理论依据。

1 试验方法

1．1 试验材料

黑果花楸果实，产地俄罗斯，由东北林业大学森林保护学科提供。

1．2 主要试剂

无水乙醇，蒸馏水，无水碳酸钠来自天津市东丽区天大化学试剂;没食子酸，福林-酚试剂来自Sigma公司

1．3 主要仪器

ALC-1104电子天平来自北京赛多丽丝仪器系统有限公司;RE-52A旋转蒸发器来自上海亚荣生化仪器厂;722S可见分光光度计来自上海精密科学仪器有限公司;ZD-85恒温振荡箱来自国华企业

1．4 试验方法

1．4．1 原料预处理

将黑果花楸果实洗净晾干后，每次试验准确称取一定重量，用研钵研成果浆直接进行后续的提取试验。

1．4．2 Folin-ciocalteu 法测定多酚含量

(1)标准曲线的建立。准确称取50．0mg没食子酸，先加入少量蒸馏水待没食子酸完全溶解后，加入蒸馏水定容至500 mL，混合均匀得浓度为100 μg/mL的没食子酸标准液。量取该标准溶液0．125、 0．250、 0．375、 0．500、 0．625、 0．750、0．875 mL于10 mL容量瓶中，加少量蒸馏水，摇匀后加2．5 mL的0．2 mol/L福林试剂，4 min后加入2．5 mL质量分数为10%的碳酸钠溶液，加蒸馏水定容至10 mL，45℃水浴条件下保持15min，测定溶液在765 nm波长处的吸光值(A765)。进行3组平行试验，以吸光度为纵坐标，没食子酸含量(μg)为横坐标回归得标准曲线方程。

(2)黑果花楸果实多酚含量的测定。准确吸取1 mL的多酚提取液于10 mL的棕色容量瓶中，加入5 mL的5%的福林酚试剂，摇匀放置3～8 min后加入4 mL的7．5%的碳酸钠溶液，暗处放置1 h，测定溶液在750 nm波长处的吸光值，将吸光值代入标准曲线方程计算溶液的多酚含量［13］。

1．4．3 黑果花楸果实多酚的提取

本试验是以多酚得率为指标来衡量各因素对多酚提取效果的影响。

(1)液料比对黑果花楸果实多酚得率的影响。分别将一定质量的果浆(按液料比为10 mL/g、20、30、40、50、60、70 mL/g)分别加入浓度为50%的乙醇，在50℃条件下提取60 min，摇床转速为180 r/min，珠填充量为60%，珠直径为0．2 cm，抽滤，40℃旋转蒸发去除乙醇，测定多酚含量步骤同1．4．2中的(2)，以公式(1)计算多酚得率。

(2)提取时间对黑果花楸果实多酚得率的影响。分别将一定质量的果浆按最佳液料比加入50%的乙醇，在50℃的条件下分别提取0．5、1、1．5、2、2．5、3、3．5 h，摇床转速为 180 r/min，珠填充量为60%，珠直径为0．2 cm，抽滤，40℃旋转蒸发去除乙醇，测定多酚含量步骤同1．4．2中(2)，以公式(1)计算多酚得率。

(3)珠填充量对黑果花楸果实多酚得率的影响。分别将一定质量的果浆按最佳液料比加入浓度为50%的乙醇，在50℃条件下按珠填充量为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%以最佳时间进行提取，摇床转速为180 r/min，珠直径为0．2 cm，抽滤，40℃旋转蒸发去除乙醇，测定多酚含量步骤同1．4．2中(2)，以公式(1)计算多酚得率。

(4)珠直径对黑果花楸果实多酚得率的影响。分别将一定质量的果浆按最佳液料比加入浓度为50%的乙醇，在50℃条件下按最佳珠填充量分别加入珠直径为 0．2、0．3、0．4、0．5 cm 的研磨珠，以最佳时间进行提取，摇床转速为180 r/min，抽滤，40℃旋转蒸发去除乙醇，测定多酚含量步骤同1．4．2中(2)，以公式(1)计算多酚得率。

(5)提取温度对黑果花楸果实多酚得率的影响。分别将一定质量的果浆按最佳液料比加入浓度为50%的乙醇，按最佳珠填充量加入最佳珠直径的研磨珠，分别在20、30、40、50℃的条件下以最佳时间进行提取，摇床转速为180 r/min，抽滤，40℃旋转蒸发去除乙醇，测定多酚含量步骤同1．4．2中(2)，以公式(1)计算多酚得率。

(6)摇床转速对黑果花楸果实多酚得率的影响。分别将一定质量的果浆按最佳液料比加入浓度为50%的乙醇，按最佳珠填充量加入最佳珠直径的研磨珠，设置摇床转速分别为100、120、140、160、180、200 r/min，在最佳提取温度条件下以最佳提取时间进行提取，抽滤，40℃旋转蒸发去除乙醇，测定多酚含量步骤同1．4．2中(2)，以公式(1)计算多酚得率。

(7)黑果花楸果实多酚最佳提取条件的确定

通过上述单因素实验，确定了提取黑果花楸果实多酚最适宜的液料比、提取时间、珠填充量、珠直径、提取温度及摇床转速。根据单因素选出对多酚提取率显著影响的三个单因素，设计响应面，优化黑果花楸果实多酚提取工艺［14］。

2 结果与分析

2．1 标准曲线的建立

以没食子酸为标准，采用福林-酚比色法(Folin-Ciocalteu)测定黑果花楸果实中总多酚含量，测定溶液吸光度值，以吸光度值与没食子酸含量(μg)回归得标准曲线方程为:y=0．0116x+0．041，R2=0．999 5，其中，y 为吸光值;x 为没食子酸含量，μg;标准曲线如图1所示。

图1 标准曲线Fig．1 Standard curve

2．2 单因素对黑果花楸果实多酚得率的影响

2．2．1 液料比对黑果花楸果实多酚得率的影响

在提取温度为50℃，提取时间为2 h，珠填充量为60%，摇床转速为180 r/min，珠直径为0．2 cm的条件下，改变液料比，考察不同液料比对黑果花楸果实多酚提取效果如图2所示。

图2 液料比对黑果花楸果实多酚得率的影响Fig．2 Effect of solvent to material on the extraction rate of polyphenol

由图2可见，液料比对黑果花楸果实多酚多酚得率的影响较大，液料比在10 mL/g至60 mL/g内变化时，多酚得率呈上升趋势，在液料比为60 mL/g时得率达到最大，而后趋向平稳，并略有降低，这是由于随着液料比的增加，加入的乙醇量增多，对多酚的提取作用增强，因而多酚得率逐渐增加，当液料比达到60 mL/g时，加入的乙醇量已经对多酚提取充分，而后再加入更多的乙醇，多酚提取率也不会有很大的改变，略有降低可能是试验过程中的误差所致。考虑到生产成本，最终确定最佳液料比为50 mL/g。

2．2．2 提取时间对黑果花楸果实多酚得率的影响

在提取温度为50℃，液料比为50 mL/g，珠填充量为60%，摇床转速为180 r/min，珠直径为0．2 cm的条件下，改变提取时间，考察不同提取时间对黑果花楸果实多酚提取效果如图3所示。

图3 提取时间对黑果花楸果实多酚得率的影响Fig．3 Effect of extraction time on the extraction rate of polyphenol

由图3可见，提取时间对黑果花楸果实多酚得率的影响不是很大，提取时间在0．5 h至2 h内变化时，多酚得率随时间延长呈增长趋势，在提取时间为2 h时多酚得率达到最高，之后继续延长提取时间，多酚得率逐渐下降，这是由于珠磨法提取多酚是由研磨珠在振荡过程中破碎果浆而提取出来的，刚开始随着时间的增长，振荡时间加长，研磨珠对果浆的破碎效果也增强，因而多酚得率有所上升，当提取时间达到2 h时研磨珠对果浆破碎最充分，多酚得率也就达到最高，之后随着时间的延长，研磨珠在振荡过程中对多酚也起到了一定的破碎作用，因而使多酚得率降低。因此确定最佳提取时间为2 h。

2．2．3 珠填充量对黑果花楸果实多酚得率的影响

在提取温度为50℃，液料比为50 mL/g，提取时间为2 h，摇床转速为180 r/min，珠直径为0．2 cm的条件下，改变珠填充量，考察不同珠填充量对黑果花楸果实多酚提取效果如图4所示。

图4 珠填充量对黑果花楸果实多酚得率的影响Fig．4 Effect of bead loading level on the extraction rate of polyphenol

由图4可见，珠填充量对黑果花楸果实多酚得率影响较小。珠填充量在20%至60%内变化时，多酚得率逐渐增加，在珠填充量为60%时多酚得率达到最高，而珠填充量为60%至80%时，多酚得率有所下降，其原因与时间对多酚得率的影响原因类似，当珠填充量较少时，随着珠填充量的增加，研磨珠对果浆研磨效果增强，使得多酚得率呈上升的趋势，当珠填充量达到60%时研磨珠对果浆的研磨效果达到最强，因而多酚得率也达到最高，之后再增加珠填充量，研磨珠会一定的程度的破碎多酚，使得多酚得率降低。因此确定最佳珠填充量为60%。

2．2．4 珠直径对黑果花楸果实多酚得率的影响

在提取温度为50℃，液料比为50 mL/g，提取时间为2 h，摇床转速为180 r/min，珠填充量为60%的条件下，改变珠直径，考察不同珠直径对黑果花楸果实多酚提取效果如图5所示。

图5 珠直径对黑果花楸果实多酚得率的影响Fig．5 Effect of bead loading level on the extraction rate of polyphenol

由图5可见，珠直径对黑果花楸果实的多酚得率影响较小。多酚得率随着珠直径的增大呈直线下降趋势，原因可能是珠直径越大，同样的珠填充量的条件下珠的表面积就越小，研磨珠对果浆的研磨不够充分研磨，从而使多酚得率降低。因此确定最佳珠直径为0．2 cm。

2．2．5 提取温度对黑果花楸果实多酚得率的影响

在珠直径为0．2 cm，液料比为50 mL/g，提取时间为2 h，摇床转速为180 r/min，珠填充量为60%的条件下，改变提取温度，考察不同提取温度对黑果花楸果实多酚提取效果如图6所示。

图6 提取温度对黑果花楸果实多酚得率的影响Fig．6 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polyphenol

由图6可见，提取温度对黑果花楸果实多酚得率影响较大。温度在20～50℃变化时，多酚得率随着提取温度的增加而呈显著上升趋势，提取温度为50℃时多酚得率达到最大，本试验没有考察提取温度为60℃时对多酚得率的影响主要是因为试验仪器最高温只能达到50℃，并且有研究表明，多酚在60℃时就开始氧化，因此确定最佳提取温度为50℃。

2．2．6 摇床转速对黑果花楸果实多酚得率的影响

在珠直径为0．2 cm，液料比为50 mL/g，提取时间为2 h，提取温度为50℃，珠填充量为60%的条件下，改变摇床转速，考察不同摇床转速对黑果花楸果实多酚提取效果如图7所示。

由图7可见，摇床转速对黑果花楸果实多酚得率影响较小。当摇床转速在100～200 r/min变化时，多酚得率随着摇床转速的增加而呈缓慢上升趋势，转速为200 r/min时得率达到最大，这是由于在同样的提取时间下，摇床转速越大，研磨珠对果浆的破碎作用越强烈，破碎果实越充分，因而使多酚得率逐渐上升。但是由于转速为180 r/min时的得率与转速为200r/min的得率相差很小，考虑到工厂的生产成本，最终确定最佳转速为180 r/min。

图7 摇床转速对黑果花楸果实多酚得率的影响Fig．7 Effect of shaking speed on the extraction rate of polyphenol

2．3 黑果花楸果实多酚提取条件优化

2．3．1 黑果花楸果实多酚珠磨法提取各因素水平的建立

以单因素试验为基础，选出其中对多酚得率影响最显著的3个因素，根据Central-Composite设计试验，建立响应面试验的各个因素水平见表1。

表1 因素水平表Tab．1 Factor levels

2．3．2 黑果花楸果实多酚珠磨法提取响应面试验结果与分析

按以上设计的因素水平对黑果花楸果实进行珠磨法提取，抽滤，40℃旋转蒸发去除乙醇，定容至100 mL，稀释一定倍数测其多酚含量，测定结果见表2。

表2 响应面分析方案及试验结果Tab．2 analyzing alternatives and test results response surface

2．3．3 回归方程的建立与检验

通过 MyDesign．dx8．0．6 响应面软件对 Central-Composite试验设计方案得到的实验结果进行分析，得到黑果花楸果实多酚提取因素的响应面回归方程为:

Y=27．03+0．89A+0．63B+0．58C-0．064AB-0．44AC-0．12BC-1．26A2-1．30B2-1．24C2

为了确定液料比、提取时间、珠填充量对多酚得率的影响程度，对响应面数据得到的数学模型进行方差分析，见表3。

表3 提取参数数学回归分析结果Tab．3 Extract parameter mathematical regression analysis results

由方差分析结果可知，对该二次多项式方程进行失拟性检验的P值为0．055 6，说明失拟性差异不显著，二次多项式方程显著性检验的P值为0．001 2，表明该方程的拟合度显著，以上数据说明二次多项式回归方程的预测值与实际值吻合度较好，证明模型成立。此外，在方差分析中的F值越大，表明实验因素对指标的影响越大。根据各因素的F值，三种提取条件对黑果花楸果实多酚得率影响的大小顺序为:液料比(F值=10．52)＞时间(F值=5．16)＞珠填充量(F值=4．37)。

通过软件Design Expert8．0．6基于实验数据计算得出结果，黑果花楸果实多酚提取最优条件为:液料比为 63．20，时间为 2．11 h，珠填充量为61．65%，在此条件下，多酚得率为27．29 mg/g。

在优化了三种提取条件之后，本研究利用响应面法对这三种提取条件两两之间的交互作用进行了三维曲面模拟并进行了分析，模拟结果如图8～图10所示。

图8 液料比与时间的交互作用响应面图Fig．8 Interaction of the solvent to material and time response surface figure

图9 液料比与填充量的交互作用响应面图Fig．9 Interaction of the solvent to material and loading level response surface figure

图10 填充量与时间的交互作用响应面图Fig．10 Interaction of the loading level and time response surface figure

由方差分析结果可知，在对黑果花楸果实多酚的提取过程中三种提取条件两两之间交互作用的强弱顺序结果为:液料比-填充量(F值=1．49)＞时间-填充量(F值=0．11)＞液料比-时间(F值=0．031)。

由方差分析结果可知，液料比因素(P值=0．008 8)对黑果花楸果实多酚提取得率有极显著的影响，时间因素(P值=0．046 5)对多酚得率有显著影响，填充量因素(P值=0．063 1)的显著性较低，说明填充量对多酚提取效果影响较小。

2．3．4 黑果花楸果实多酚珠磨法提取工艺验证试验

按照软件Design Expert8．0．6分析得到的最优提取条件:液料比63．20 mL/g，时间2．11 h，珠填充量61．65%进行试验，结果多酚得率为27．27 mg/g，与预测得率误差为0．02%，试验结果可靠，具有一定的实际预测性。

3 结论

响应面试验结果表明，三种主要因素对黑果花楸果实多酚得率的影响顺序依次为:液料比＞时间＞珠填充量。液料比对多酚得率有极显著的影响，时间对多酚得率的影响为显著，而珠填充量对多酚得率影响不大，因此，在实际操作中，应注意调节好液料比与时间的关系，更能有效的提取多酚。珠磨法提取黑果花楸果实多酚的最佳工艺为:液料比63．20 mL/g，时间 2．11 h，珠填充量 61．65%，预测多酚得率为27．29 mg/g，试验结果多酚得率为27．27 mg/g，误差为0．02%，说明试验结果可靠。本研究为采用珠磨法提取黑果花楸果实多酚提供理论基础，为黑果花楸的开发利用提供了新的思路。

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