己糖激酶-Ⅱ在直肠癌组织中表达临床意义



己糖激酶-Ⅱ在直肠癌组织中表达临床意义

龚海*，石欣，刘双海

（东南大学附属江阴医院肛肠外科，江苏214400）

[摘要]目的：检测己糖激酶-Ⅱ基因在直肠癌组织中表达，探讨其与患者预后的关系。方法：通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白质印迹方法、免疫组织化学方法了解己糖激酶-Ⅱ在直肠癌100例组织中表达，探讨与肿瘤病理因素关系。结果：RT-PCR和蛋白质印迹法结果显示直肠癌组织阳性表达己糖激酶-Ⅱ在RNA水平显著高于正常组织阳性表达。直肠癌组织中己糖激酶-Ⅱ表达阳性率显著高于对照组（P＜0.01）。肿瘤大小、分化程度、合并肿瘤分期与己糖激酶-Ⅱ的表达呈正相关（P值分别为P=0.001，P=0.000，P=0.019），而淋巴转移与否与己糖激酶-Ⅱ的表达无相关性（P=0.815）。结论：直肠癌组织中HK-Ⅱ呈高表达，HK-Ⅱ抑制剂能抑制肿瘤糖酵解从而抑制肿瘤生长、增殖，促进肿瘤凋亡，为肿瘤治疗提供契机。

[关键词]直肠癌；己糖激酶-Ⅱ；逆转录-聚合酶链反应；蛋白质印迹法；免疫组织化学法

2000年Hanahan等[1]在Cell杂志上提出了能量代谢失衡是肿瘤细胞特征之一。而己糖激酶（hexokinase，HK）是糖酵解的关键限速酶，能将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，为恶性肿瘤细胞提供能量从而促进肿瘤的生长及增殖。HK家族有多种亚型，大多数恶性肿瘤在HK-II亚型中呈高表达。国内外在肝癌、乳腺癌、结肠癌等方面有所探讨，但在直肠癌中目前相关资料比较少。本研究通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）、蛋白质印迹法（Western-blot）、免疫组织化学法了解己糖激酶-Ⅱ在直肠癌组织中表达，并分析其与肿瘤大小、临床分期、分化程度、淋巴结有无转移等临床特征之间的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料直肠癌根治术100例肿瘤新鲜标本、癌组织石蜡标本及距离肿瘤2cm癌旁组织的石蜡标本，其中新鲜标本于标本离体后0.5小时内放入液氮中保存。入组标准：（1）病理诊断明确，病理分期采用美国肿瘤研究联合会（AJCC）和国际抗癌联盟（UICC）共同制定公布的第7版TNM分期；（2）患者未接受术前化疗或放疗；（3）患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1RT-PCR：按试剂说明行RNA提取，取2μgRNA应用逆转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA；HK-II及GAPDH引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。HK-II（442bp）上游引物：5’-GGC AAT GAA ACC AAA GCC AGG AG-3’，下游引物：5’-GGA AGG AGG AGC CAG AAG CAA CC-3’；GAPDH（715bp）上游引物：5’-CAA ATT CCA TGG CAC CGT CA-3’，下游引物：5’-GGA GTG GGT GTC GCT GTT GA-3’；每对引物均位于不同的外显子，避免扩增包含基因组DNA，管家基因GAPDH作内参。PCR反应程序（HK-II）：94℃预变性5min，94℃1min，58℃45s，72℃1min，35个循环，4℃恒温保存。PCR反应程序（GAPDH）：94℃预变性5min，94℃45s，58℃45s，72℃45s，35个循环，4℃恒温保存。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统对凝胶进行扫描拍照。

1.2.2Western-blot印迹法：提取直肠癌组织及癌旁正常组织蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定肿瘤细胞蛋白浓度。然后行蛋白电泳，电泳凝胶有10%分离胶和5%浓缩胶，每孔上样60μg蛋白进行电泳。电泳电压为40V，待溴酚兰电泳进入至分离胶后，将电压提高至60V，直至溴酚蓝到达玻璃板底部时则停止电泳，电转移至PVDF膜。放于室温下晾干至过夜，DAB染色1～5min，出现清晰条带时终止显色，凝胶电泳图像扫描仪进行扫描及图像分析。

1.2.3免疫组化法检测：将石蜡切片标记好后脱蜡及水化，采用柠檬酸钠法进行抗原修复，用湿切片笔将石蜡组织圈起来阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗除去多余非特异性抗原，加兔抗人单克隆抗体，滴加DAB显色液，用苏木素核复染后脱水和透明，镜下观察免疫组化结果。判断标准：阳性染色为细胞质中出现棕黄色颗粒。每张切片选择5个高倍视野（10×20），计数不少于500个细胞，取均数并评分。不着色为0分，淡色为1分，深色为2分。着色细胞占计数细胞百分比：＜5%为0分，6%～25%为l分，26% ～50%为2分，＞51%为3分。染色程度与染色细胞百分比乘积为最终计算结果，乘积＞1分阳性。两组应用ImageProPlus软件采用定量法分析实验切片，随机选取5个高倍视野，计算单位阳性面积IOD值（积分光密度值），比较两组间差异。该值越低，表明切片透光性越弱，染色越深，即切片阳性染色颗粒越多，反映染色阳性的HK-Ⅱ蛋白越多。

1.3统计学处理应用SPSS13.0统计软件分析，计量指标采用x-±s表示，组间差异性比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结　果

2.1RT-PCR检测结果显示直肠癌HK-II阳性表达在RNA水平显著高于正常组织HK-II中的表达（图1）。

图1　RT-PCR检测结果

2.2Western-blot检测结果显示直肠癌HK-II阳性表达在蛋白质水平显著高于正常组织HK-II中的表达（图2）。

图2　Western-blot检测结果

2.3免疫组化检测结果显示直肠癌HK-II阳性表达在蛋白质水平显著高于正常组织HK-II中的表达（图3）。

2.4直肠癌组织与直肠组织中HK-II表达与患者临床病理因素的关系见表1。

图3　免疫组化检测结果（200×）

表1　直肠癌组织与直肠组织中HK-II表达与患者临床病理关系　例（%）

3　讨　论

直肠癌在我国是常见的恶性肿瘤之一，目前其发病率有逐年上升的趋势，平均年递增速度约为4.2%[2]。直肠癌的发病与饮食、环境、炎性肠病、遗传、结肠息肉等多种因素有关。近年来随着分子生物学相关技术的发展，可从基因水平进一步揭示直肠癌发病原因。1931年Warburg发现[3]，恶性肿瘤优先利用糖酵解释放的能量来满足细胞的需要。也就是说肿瘤细胞即使氧气供应充足，能够比正常组织把更多的葡萄糖代谢为乳酸，即所称的Warburg效应。在哺乳类动物的体内，一共有4种亚型的己糖激酶，其中HK-Ⅱ与恶性肿瘤关系密切。HK-Ⅱ的升高对于促进恶性肿瘤细胞糖酵解具有重要的意义，有力的糖酵解和生物合成代谢途径，为肿瘤在宿主组织内不受控制的增殖提供了正性的支持[4-5]。研究表明分化型结肠癌氧化磷酸化比例高于未分化型，未分化型结肠癌细胞中糖酵解比例升高，因此HK-Ⅱ可能是肿瘤生长速率的指标[6]。对人类结肠癌移植肿瘤中不同移植瘤的分析表明，结肠癌中HK-Ⅱ活性的差异与肿瘤生长具有相关性，可作为肿瘤生长速率指标[6]。因此己糖激酶对于恶性肿瘤细胞的生存起着重要的作用。

本实验在基因水平和蛋白水平，检测HK-Ⅱ在直肠癌切片中的表达情况。免疫组织化学法检测发现，在直肠癌组织中HK-Ⅱ表达阳性率明显高于正常直肠组织。证实在直肠癌组织中HK-Ⅱ明显高表达，与其他文献结果一致。同时发现在癌组织中，HK-Ⅱ的高表达与肿瘤的大小、组织分化及临床病理Dukes分期间呈明显正相关。HK-Ⅱ的表达在淋巴结转移与否无明显相关性，分析发现部分肝转移病例淋巴结无转移，考虑这可能影响统计分析。结果证明肿瘤越大，HK-Ⅱ的表达越高，表明在较大的肿瘤中存在较强的无氧糖酵解。结果证明分化程度越低，HK-Ⅱ表达越高，表明在分化较差的肿瘤中糖酵解增强。结果证明肿瘤临床分期的越晚，HK-Ⅱ阳性表达率越高。

氯尼达明等药物抑制HK来促进肿瘤细胞凋亡，HK的抑制剂在早期动物试验中已经取得一定的成果[7-8]。但是关于HK-Ⅱ与肿瘤的关系主要是来自肿瘤细胞株，而目前以患者为对象的研究少见。本实验研究结果显示，直肠癌组织中HK-Ⅱ呈高表达，假如使用HK-Ⅱ抑制剂来抑制肿瘤糖酵解从而抑制肿瘤生长、增殖，促进肿瘤凋亡，此可为肿瘤的治疗提供了契机，很可能成为当今肿瘤研究的一个新热点。

[参考文献]

[1] Hanahan D，Weinberg RA. Hall marks of cancer:the next Generation［J］. Cell，2011，144（5）：646-674.

[2]任东林，郭学峰.新辅助治疗在直肠癌治疗中的应用和评价［J］.医学新知杂志，2008，18（2）：68-70.

[3] Warburg O. On the origin of cancer cells［J］.Science，1956，123（3191）：309-314.

[4] Pedersen PL，Mathupala S，Rempel A，et al. Mitochondrial bound type II hexokinase：a key player in the growth and survival of many cancers and an ideal prospect for therapeutic intervention［J］. Biochim Biophys Acta，2002，1555（1/ 3）：14-20.

[5] Mathupala SP，Ko YH，Pedersen PL. Hexokinase II：cancer’s double-edged sword acting as both facilitator and gatekeeper of malignancy when bound to mitochondria［J］. Oncogene，2006，25（34）：4777-4786.

[6] Burt BM，Humm JL，Kooby DA，et al. Using positron emission tomography with（18）F FDG to predict tumor behavior in experimental colorectal cancer［J］. Neoplasia，2001，3（3）：189-195.

[7] Ko YH，Pedersen PL，Geschwind JF. Glucose catabolism in the rabbit VX2 tumor model for liver cancer：characterization and targeting hexokinase［J］. Cancer Lett，2001，173（1）：83-91.

[8] Geschwind JF，Georgiades CS，Ko YH，et al. Recently elucidated energy catabolism pathways provide opportunities for novel treatments in hepatocellular carcinoma［J］. Expert Rev Anticancer Ther，2004，4（3）：449-457.

The clinical value of Hexokinase-II expression in carcinoma of the rectum

GONG Hai，SHI Xin，LIU Shuanghai

（Department of Anorectal Surgery，Jiangyin Hospital Affiliated to Nantong University，Jiangsu 214400）

[Abstract]Objective:To study the expression of Hexokinase-II in carcinoma of the rectum，and analyze the relationships between HK-II expression and the clinical features. Methods: The expression of HK-II in 100 carcinoma of the rectum tissue was checked by using reverse transcriptase polymerase chain reaction，Western blot and inununohistochemistry technique.Then the relationships between HK-II expression and the clinical features of carcinoma of the rectum patients were further investigated，such as tumor sizes，clinical stages，differentiation levels，lymphatic metastasis. Results:RT-PCR result showed that positive expression HK-II in carcinoma of the rectum tissue were higher than that in normal tissue on RNA level.Western blot result showed that positive expression HK-II in carcinoma of the rectum tissue were higher than that in normal tissue on protein level.Inununohistochemistry results showed that the cancer tissue had more positive expression than normal rectal mucosa tissue（P=0.000）.Inununohistochemistry results showed that tumor sizes，differentiation levels and merger of tumor stages was related with positive expression HK-II（prespectively 0.001，0.000，0.019），lymphatic metastasis was not related with positive expression HK-II（P=0.815）. Conclusions:The cancer tissue had more positive HK-II expression than normal rectal mucosa tissue. Tumor sizes，clinical stages and differentiation levels were related with positive expression of HK-II，lymphatic metastasis was not related with positive expression of HK-II.

[Key words]carcinoma of the rectum；Hexokinase-II；reverse transcriptase polymerase chain reaction；Westernblot；Inununohistochemistry

[收稿日期]2014-10-22

* [作者简介]龚海，男，汉族，江苏江阴人，生于1973年9月，本科，副主任医师。研究方向：结直肠肛门病外科。

[文章编号]1006-2440（2015）01-0020-04

[文献标志码]A

[中图分类号]R735.3+7