膜联蛋白A7表达抑制对HepG－2细胞中galectin－3及PKC 表达的影响

田焕娜 王小杰 梁秀军 陈 龙 刘兰芳 李 欣＊

（1承德医学院基础医学研究所，承德067000；2承德医学院附属医院肿瘤内科，河北067000）

膜联蛋白A7（annexin A7，ANXA7）是膜联蛋白家族成员，该家族成员具有广泛的生物学功能，包括膜转运、细胞分化、凋亡、生长调节及钙离子信号途径等［1－2］。.ANXA7除具有该家族典型的磷脂结合特性、Ca2＋通道形成特性等外，其在多种肿瘤组织中出现了表达改变。研究发现，ANXA7表达异常与前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、转移性黑色素瘤［5］以及多形性胶质细胞瘤［6］的发生发展相关。在肝癌中，ANXA7的表达显著增高与肝癌进展成正相关，当抑制了ANXA7的表达后，肝癌细胞的移动和侵袭性显著下降，细胞凋亡率增高，而且在高转移性肝癌细胞中表达显著高于低转移的肝癌细胞，但是ANXA7在肝癌发生发展过程中的具体作用机制并不清楚。我们先前的研究发现，当抑制肝癌细胞系HepG－2细胞中ANXA7的表达后，HepG－2细胞出现了增殖抑制［7］。半乳糖凝集素家族成员galectin－3的高表达与多种肿瘤转移有关，其具有抗肿瘤细胞凋亡的作用。

本研究在前期工作基础上，采用人肝癌细胞系HepG－2细胞为研究对象，在抑制ANXA7表达后检测galectin－3的表达改变；用PKC激活剂PMA处理ANXA7表达受抑的细胞，检测ANXA7及PKC表达变化，为深入探索ANXA7在肝癌中的作用机制研究提供基础。

材料和方法

1.试剂和仪器设备

转染试剂Lipofectamine2000、靶向ANXA7的siRNA、Trizol试剂、反转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒均为美国Invitrogen公司产品；ANXA7单克隆抗体购自美国Sigma公司；galectin－3多克隆抗体购自福建迈新公司；PKC单克隆抗体购自美国abcam公司；PMA购自Enzolife公司；所用引物由上海生工科技有限公司合成；细胞总RNA提取试剂盒为北京百泰克生物技术公司产品；细胞培 养 基 （Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）为美国GIBCO公司产品；蛋白定量试剂盒购于上海生工生物工程有限公司；紫外分光光度计（Thermo labsystems Multiskan MK3）为 Thermo公司产品；CO2培养箱（HERAceu150）为德国贺利氏公司产品。

2.细胞培养

HepG－2细胞购自上海中科院细胞库，用含10%胎牛血清的DMEM于5%CO2的37℃孵箱中常规培养。

3.siRNA细胞转染

转染前一天将细胞按2×105／孔种植于6孔板中，使细胞在24h达到40－70%的密度；将细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组。按照脂质体LipofectamineTM2000试剂说明书，按siRNA oligo 20pm／孔、脂质体5μl／孔，分别将siRNAoligo和脂质体加入无抗生素、无血清的DMEM培养液250μl中混匀，静置5min。然后将两液混合，室温放置20min。将500μl脂质体／siRNA混悬液逐滴加入培养板，轻轻混匀，置于培养箱。转染后6h更换含血清培养基。

4.Western blot

细胞转染48h后，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度；将蛋白质变性后经12%SDS－PAGE电泳，每泳道30μg。电泳后电转膜（电转缓冲液：Tris 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200mL），湿法转至PVDF膜；5% 脱脂奶粉／TBST溶液封闭2h，将膜浸入1∶1000稀释的ANXA7鼠抗人单克隆抗体，4℃过夜；加入羊抗鼠二抗（1∶1000稀释），室温孵育2h；ECL检测。同时检测相应细胞β－actin的表达作为内参照。转染48h后用100ng／ml PMA处理24h，Western blot检测各组细胞中ANXA7和PKC表达，步骤同上。应用 Quantity One V4.52软件进行结果分析，以目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度比值作为蛋白相对表达水平。

5.RT－qPCR反应

Trizol法提取细胞总RNA后，以其为模板使用反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。分别对目的基因和β－actin进行实时定量PCR检测。参照Genebank上各基因序列的编码区，由TAKARA公司设计引物：ANXA7上游引物5’aaaggtgctggcacagatgac 3’，下游引物为5’tggcccacaatagccagaag 3’，扩增的基因片段为176bp。galectin－3的基因序列（Genebank AB006780.1），设计引物：上游引物5’taacccacgcttcaatgagaacaa 3’，下游引物为 5’acaagtgagcatcattcactgcaac 3’，扩增的基因片段为179bp。β－actin为内参，上游引物5’tggcacccagcacaatgaa 3’，下游引物为5’ctaagtcatagtccgcctagaagca 3’，扩增的基因片段长度为186bp。反应体系20uL：SYBR PremixEx TaqⅡ（2×）10μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference DyeⅡ0.4μl，cDNA 模板1.48μl，ddH2O 6.52μl。反应条件为：预变性95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃延伸30s，共40个循环。

6.统计学分析

结 果

1.Western blot检测siRNA的干扰效果

转染后48h，经 Western blot检测结果显示，siRNA干扰组中ANXA7表达较阴性对照组和空白对照组有明显下降。图1结果显示siRNA显著抑制了HepG－2细胞中ANXA7的表达。

图1 Western blot法鉴定siRNA抑制ANXA7表达结果。1：siRNA干扰组；2：转染阴性对照组；3：空白对照。siRNA干扰组与其它两组细胞相比较，＊P＜0.05Fig.1Expression of ANXA7by western blot.1：siRNA interference group；2：negative control group；3：blank control group.＊P＜0.05，compared with negative control group and blank control group

2.RT－qPCR检测siRNA的干扰效果

为了进一步验证AXNA7siRNA对MGC－803细胞AXNA7蛋白基因转录的抑制效果，我们再次采用RT－qPCR法在mRNA水平进行了检测，结果见图2

图2 RT－qPCR法检测 AXNA7mRNA表达结果。siRNA干扰组与其它两组细胞相比较，＊P＜0.05Fig.2Expression of AXNA7mRNA by RT－qPCR.＊P＜0.05，compared with negative control group and blank control group

3.Western blot检测galectin－3在 ANXA7表达抑制的HepG－2细胞中的表达

当ANXA7的表达抑制效果确定后，Western blot法检测各组细胞中galectin－3的表达，结果发现与阴性对照组和空白对照组相比较，siRNA干扰组中galectin－3在蛋白水平表达显著下降，如图3所示。

图3 Western blot法检测HepG－2细胞ANXA7表达抑制后galectin－3的表达。1：siRNA干扰组；2：阴性对照组；3：空白对照组。siRNA干扰组与其它两组细胞相比较，＊P＜0.05Fig.3Expression of galectin－3after ANXA7knockdown in HepG－2cells by western blot.1：siRNA interference group；2：negative control group：3：blank control group.＊P＜0.05，compared with negative control group and blank control group

4.RT－qPCR 检测galectin－3在 ANXA7表达抑制的HepG－2细胞中的表达

为了进一步证实galectin－3在ANXA7表达抑制的HepG－2细胞中的表达结果，我们再次采用RT－qPCR法在mRNA水平进行了检测，结果发现galectin－3在转录水平表达显著下降，见图4。

5.PMA处理后PKC及ANXA7在ANXA7表达抑制的HepG－2细胞中的表达

将siRNAoligo转染HepG－2细胞后48h，用终浓度为100ng／mL的PMA处理24h，Western blot法检测siRNA干扰组，阴性对照组和空白对照组HepG－2细胞以及相对应各组加药处理后的细胞中PKC及ANXA7的表达，结果显示在六组细胞中PKC的表达无显著改变；与阴性对照组和空白对照组相比，siRNA干扰组ANXA7表达显著降低；与（阴性对照＋PMA）组和（空白对照＋PMA）组相比，（siRNA干扰＋PMA）组中ANXA7表达显著降低；PMA处理前后各组细胞中ANXA7表达无显著差异。如图5所示。

图4 RT－qPCR检测galectin－3mRNA在 ANXA7表达抑制的细胞中的表达。1：siRNA干扰组；2：阴性对照组；3：空白对照组。siRNA干扰组与其它两组细胞相比较，＊P＜0.05Fig.4Galectin－3mRNA expression in the ANXA7 knockdown cells by RT－qPCR.1：siRNA interference group；2：Negative control group；3：Blank control group.＊P＜0.05，compared with negative control group and blank control group

图5 Western blot法检测转染ANXA7并加PMA处理后细胞中PKC及ANXA7的表达。1：siRNA干扰组；2：阴性对照组；3：空白对照组。4：PMA处理的siRNA干扰组；5：PMA处理的阴性对照组；6：PMA处理的空白对照组。Fig.5PKC and ANXA7expressing after transfection siRNA and PMA treatment by Western blot.1：siRNA interference group；2：Negative control group；3：Blank control group；4：siRNA interference and PMA treatment group；5：Negative control and PMA treatment group；6：blank control and PMA treatment group.

讨 论

膜联蛋白家族是Ca2＋依赖的磷脂结合蛋白家族，该家族在细胞内含量丰富，约占总蛋白量的1%－2%，参与细胞内许多重要的生物学过程。ANXA7是膜联蛋白家族最早发现的一个成员［8］，研究发现，ANXA7在多种肿瘤组织中出现表达异常，其表达失调与肿瘤进展和预后密切相关。通过对乳腺肿瘤样本的大量分析，ANXA7的表达显著增高，而且ANXA7表达越高，患者存活率越低［4］；肺癌组织芯片结果显示，在高分级的肿瘤中ANXA7高表达，并与低生存率相对应［4］。当抑制了ANXA7的表达后，肝癌细胞的移动和侵袭性显著下降，细胞凋亡率增高［9－10］，而且在高转移性肝癌细胞中表达显著高于低转移的肝癌细胞［11］；我们先前的研究发现，当抑制肝癌细胞系HepG－2细胞中ANXA7的表达后，HepG－2细胞出现了增殖抑制。本研究继续使用肝癌HepG－2细胞为实验模型，探讨ANXA7表达抑制后细胞发生增殖和凋亡改变的可能的机制。

研究发现ANXA7可通过和galectin－3相互作用调控细胞的抗凋亡活性［12］。galectin－3是半乳糖凝集素家族成员，是一种可见于胞核、胞浆以及细胞外环境的多功能肿瘤抑制蛋白，它参与细胞黏附、免疫调节、新血管形成及肿瘤浸润转移等多种生理和病理过程。在凋亡诱导剂作用下，galectin－3转位至核周膜，富集于线粒体并防止其被破坏和细胞色素C的释放，对多种肿瘤细胞具有抗凋亡作用［13］，使用siRNA干扰ANXA7mRNA时，ANXA7表达下调，galectin－3便不能转移到核周膜，这提示ANXA7在galectin－3的运输中发挥了作用。我们在抑制ANXA7表达后，在蛋白水平和RNA水平分别检测了galectin－3的表达，结果显示galectin－3的表达显著降低。由此我们推测抑制ANXA7表达导致HepG－2细胞增殖抑制可能和galectin－3的表达降低有关。

研究证实ANXA7还具有Ca2＋激活的GTP水解酶活性，并且随着胞内颗粒的向外分泌活性加强［14］。Ca2＋，GTP和PKC共同使 ANXA7具有促进胞吐过程中细胞膜融合的活性［15］。PKC不仅是肿瘤细胞转化的重要信号分子，也是介导肿瘤细胞黏附、运动、侵袭及转移的关键因素。有研究表明，PMA长时间处理细胞对PKC的调节存在组织和细胞特异性。我们在抑制ANXA7表达后，根据文献报道用100ng／ml PMA处理细胞24h，在蛋白水平检测了PKC和ANXA7的表达，结果显示与未处理组相比PKC及ANXA7的表达无显著差异。我们推测单独激活PKC并不能引起ANXA7表达显著变化。我们将用不同时间点及不同浓度PMA处理细胞来检验该推测是否准确。此外，出现上述结果的原因可能有诸多因素共同作用，具体原因有待于我们继续研究。

基于以上实验结果，结合galectin－3具有抗肿瘤细胞凋亡的作用，我们推测，抑制ANXA7表达导致HepG－2细胞增殖抑制的机理有可能是通过下调galectin－3的表达而导致，其具体机制亟待我们进一步深入研究解决。

［1］Gerke V，Creutz CE，Moss SE.Annexins：linking Ca2＋signalling to membrane dynamics.Nat Rev Mol Cell Bio，2005，6（6）：449－461

［2］Fatimathas L，Moss SE.Annexins as disease modifiers.Histol Histopathol，2010，25（4）：527－532

［3］Srivastava M，Bubendorf L，Srikantan V，et al.ANX7，a candidate tumor suppressor gene for prostate cancer.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（8）：4575－4580

［4］Srivastava M，Bubendorf L，Raffeld M，et al.Prognostic impact of ANX7－GTPase in metastatic and HER2－negative breast cancer patients.Clin Cancer Res，2004，10（7）：2344－2350

［5］Kataoka TR，Ito A，Asada H，et al.Annexin VII as a novel marker for invasive phenotype of malignant melanoma.Jpn J Cancer Res，2000，91（1）：75－83

［6］Yadav AK，Renfrow JJ，Scholtens DM，et al.Monosomy of chromosome 10associated with dysregulation of epidermal growth factor signaling in glioblastomas.JAMA，2009，302（3）：276－289

［7］王小杰，李欣.膜联蛋白A7低表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响.解剖学报，2013，29（5）：656－660

［8］Creutz CE，Pazoles CJ，Pollard HB.Identification and purification of an adrenal medullary protein （synexin）that causes calcium－dependent aggregation of isolated chromaffin granules.J Biol Chem，1978，253（8）：2858－2866

［9］Yuhong Huang，Qing Wanga，Yue Du，et al.Inhibition of annexin A7gene and protein induces the apotosis and decreases the invasion，migration of the hepatocarcinoma cell line.Biomed Pharmacother，2014，68，819－824

［10］Mohammed Mohammed Ibrahim，Ming－Zhong Sun，Yuhong Huang，et al.Down－regulation of ANXA7decreases metastatic potential of human hepatocellular carcinoma cells in vitro.Biomed Pharmacother，2013，67（4），285－291

［11］Srivastava M，Bubendorf L，Nolan L，et al.ANX7as a bio－marker in prostate and breast cancer progression.Dis Markers，2001，17（2）：115－120

［12］Wang YG，Kim SJ，Baek JH，et al.Galectin－3increases the motility of mouse melanoma cells by regulating matrix metalloproteinase－1expression.Exp Mol Med，2012，44（6）：387－393

［13］Yu F，Finley RL Jr，Raz A，et al.Galectin－3translocates to the perinuclear membranes and inhibits cytochrome c releasefrom the mitochondria.A role for synexin in galectin－3translocation.J Biol Chem，2002，277（18）：15819－15827

［14］Caohuy H，Srivastava M，Pollard HB.Membrane fusion protein synexin （annexin VII）as a Ca2＋／GTP sensor in exocytotic secretion.Proc Natl Acad Sci，1996，93（20）：10797－10802

［15］Caohuy H，Pollard HB.Protein kinase C and guanosine triphosphate combine to potentiate calcium－dependent membrane fusion driven by annexin 7.J Biol Chem，2002，277（28）：25217－25225