姜黄素对糖尿病大鼠大脑海马神经元的作用研究

尧 青 郑 东 陈红光

（湖北科技学院糖尿病心脑血管病变重点实验室，咸宁437100）

糖尿病脑病作为糖尿病独立的一个并发症已被 医学界所公认，并逐渐成为基础和临床等相关学科的研究热点。大量的流行病学研究表明不受控制的糖尿病会导致轻度的认知功能障碍，增加阿尔茨海默病的风险［1－3］。海马是大脑边缘系统的重要组成部分，通过脑干网状结构系统和皮质下行纤维接受来自视、听、痛、触等多种感觉信息，参与外界信息向中枢传导的整合，是研究大脑学习记忆功能的理想模型。有研究发现，高血糖一个月时脑颞叶皮层、海马等区域内未发现明显微血管病变，但神经元已出现退行性改变［4］，可见海马形态结构的变化与糖尿病所致的认知功能障碍等脑部病变密切相关。许多研究表明，姜黄属中具有降脂、抗氧化、抗炎、抗微生物等多方面药理作用的一种黄色酚类化合物——姜黄素（Curcumin，Cur）对糖尿病［5］及其常见并发症［6－10］有保护作用，然而它在糖尿病脑部病变中的治疗作用研究还比较少，因此通过检测大鼠海马神经元中凋亡相关因子Bcl－2，Bax和caspase－3的表达情况，观察姜黄素对STZ诱导的2型糖尿病大鼠海马是否有抗凋亡的保护作用，为糖尿病脑部病变的研究和治疗提供一些实验依据。

材料和方法

1.实验动物和试剂

健康雄性SD大鼠100只，体重100－160g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。STZ（Sigma公司，货号 S0130），兔抗 Bcl－2抗体（sigma公司，货号SAB4500003），兔抗Bax抗体（Abcam公司，货号ab16837），兔抗caspase－3抗体（Abcam 公司，货号ab59388），免疫组化试剂盒（谷歌生物，货号G1003－2，包括HRP标记的二抗和DAB）。

2.模型制备及分组

实验动物均饲养于SPF动物房，适应性喂养1周后，给予20只大鼠正常饮食作为生理盐水对照组（Con租），给予80只大鼠高糖高脂饲料（由普通饲料加20%猪油和10%白糖组成）饮食作为糖尿病模型组（DM组）和姜黄素处理的模型组（DM＋Cur组）。4周后，Con组继续给予正常饮食，DM组和DM＋Cur组大鼠通过腹腔注射STZ 35mg／kg来复制2型糖尿病模型。STZ注射72h后尾静脉采血测血糖，以随机血糖浓度≥16.7mmol／L作为糖尿病模型建立的成功标准。DM造模成功后，DM组大鼠继续喂以高糖高脂饮食，DM＋Cur组大鼠则给予高糖高脂饲料和姜黄素300mg／kg／天（姜黄素由1%的羧甲基纤维素钠（Na－CMC）配制，放入大鼠的水瓶中让其饮用）处理。实验过程中，监测大鼠体重及摄食量。姜黄素处理16周后，处死大鼠，检测后续相关指标。

3.免疫印迹（Western Blot，WB）检测

各组大鼠处死后，迅速于冰上取海马以0.1g组织加1ml蛋白裂解液的比例提取组织蛋白。根据常规的WB流程检测各组大鼠大脑海马中Bcl－2和Bax的蛋白含量：先用60～80V的电压进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）电泳，然后将目的蛋白于250mA恒流转膜80min转移至PVDF膜；TBST溶液洗膜5min×3次；5%脱脂牛奶室温封闭2h；兔抗一抗（1：1000）于4℃孵育膜过夜；TBST溶液洗膜10min×3次；HRP标记的山羊抗兔IgG（1：5000）室温孵育膜1h；TBST溶液洗膜10min×4次；增强化学发光（ECL）显影成像，条带用Quatity One软件进行分析。

4.免疫组织化学（IHC）检测

各组大鼠处死后，迅速取脑置于4%甲醛溶液中固定12－24h，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸润并包埋成块，石蜡切片机上行连续冠状切片，片厚5μm，贴于明胶载玻片上。切片的免疫组织化学检测，按常规免疫组化SP法操作：切片脱蜡水化；0.1%Triton X100破膜；微波修复；0.3%H2O2灭活内源性过氧化氢酶；5%BSA封闭后滴加一抗4℃过夜，兔抗caspase－3抗体1∶700；然后用 HRP标记的羊抗二抗室温孵育45－60min后行DAB显色。染色过程中各步骤之间均用PBS充分漂洗。显色完后用苏木素复染，然后脱水、透明、中性树胶封片，在Olympus BX 53显微镜下观察、摄片。免疫染色对照试验用PBS代替一抗，其余步骤相同。

5.显微图像分析和统计学处理

各组实验动物免疫染色切片均于Olympus BX53显微镜下用DP73高清成像系统进行扫描拍摄，图片用Image－Pro－Plus 6.0软件计数阳性显色的累计光密度值（IOD值）。WB条带均用Quatity One软件进行分析，计数条带灰度值。实验数据均用GraphPad Prism 5统计软件进行分析。

结 果

1.姜黄素对糖尿病大鼠体重和血糖的影响

各组大鼠在处死前检测体重和随机血糖，结果如表1所示：大鼠在SPF动物房的良好环境里饲养二十多周以后，Con组体重增加很多，达到700.2g，但是血糖一直正常。DM组在给STZ之前，体重增加迅速，给予STZ造模成功后，食量减少，同时出现多饮和多尿症状，大鼠渐渐消瘦，体重下降，并且随机血糖增高，在处死前，平均血糖达到21.04mmol／L；给予DM大鼠姜黄素处理16周后，总体状态比DM组好，体重减弱没有DM组明显，随机血糖也比DM组大鼠低，到大鼠处死前，DM＋Cur组大鼠随机血糖为16.95mmol／L，这些数据表明姜黄素能从总体 上改善大鼠的糖尿病症状。

表1 各组大鼠体重和随机血糖的比较（mean±SD）Table 1 The comparation of body weight and random blood glucose in each group rats（mean±SD）

2凋亡相关蛋白Bcl－2／Bax的WB检测结果

各组实验大鼠大脑海马的WB检测结果如图1所示，大鼠海马组织Bcl－2和Bax蛋白的表达水平呈负相关。与对照Con组相比，DM组Bcl－2蛋白表达降低而Bax蛋白表达显著升高；与DM组相比，DM＋Cur组Bcl－2蛋白表达明显升高而Bax蛋白表达降低（图1A）。根据 WB条带分析得出的Bcl－2／Bax比值的比较见图1B。

图1 A：各组大鼠大脑海马Bcl－2和Bax的WB条带图；B：Bcl－2／Bax的WB统计分析图。＊ 与Con组相比P＜0.05，＃ 与DM组相比P＜0.05。Fig.1A：The WB bands of Bcl－2and Bax in each rats hippocampus；B：The WB statistical analysis chart of Bcl－2and Bax.＊compared with Con group，P＜0.05，＃compared with DM group，P＜0.05.

3caspase－3的IHC检测结果

各组实验大鼠大脑海马caspase－3的IHC显色结果如图2所示，Con组大鼠海马CA1，CA3和齿状回（DG）均只有较低水平的caspase－3表达，而DM组大鼠海马各区的caspase－3阳性表达均较Con组明显增强，给于DM组大鼠姜黄素处理16周以后，海马caspase－3阳性表达明显减弱，可见姜黄素对DM大鼠的海马有抗神经元凋亡的作用。

讨 论

姜黄素是从姜黄属中药姜黄、郁金、莪术等的根、块茎等处提取的一种黄色酚类化合物，原用做调味剂和食物色素，现代药理学研究表明它具有降脂、

抗氧化、抗炎、抗微生物等多方面的药理作用。近年来，关于姜黄素对糖尿病［5］及其并发症如糖尿病肾病［6，7］、糖尿病心脏病变［8，9］、糖尿病眼部病变［10］等的治疗作用的一些基础和临床研究已引起国内外的重视。姜黄素对中枢神经系统疾病的积极药理作用也有 很 多 研 究，如 AD［11－13］、PD［14］、癫 痫［15］、脑 缺血［16］等。然而它在糖尿病脑部病变中的治疗作用研究还比较少，因此本文以姜黄素为目标药物，通过检测糖尿病大鼠大脑海马神经元中的凋亡调控蛋白Bcl－2与Bax和凋亡关键蛋白caspase－3的表达情况，研究姜黄素对糖尿病大鼠海马神经元的抗凋亡保护作用。

图2 A：各组大鼠大脑海马CA1区，CA3区和齿状回caspase－3的IHC显色图（×200倍）；B：各组大鼠IHC显色后的统计分析图。＊与Con组相比P＜0.05；＃与DM组相比P＜0.05.Fig.2A：The immunoreactivity of caspase－3in hippocampal CA1，CA3，and dentate gyrus areas in each group（×200）；B：The IHC statistical analysis chart of caspase－3in each group rats.＊compared with Con group，P＜0.05，＃compared with DM group，P＜0.05.

在细胞凋亡过程中，有很多蛋白和细胞因子参与调控，其中，Bcl－2蛋白家族是调节线粒体通透性的主要成分，可通过形成同源（Bcl－2／Bcl－2，Bax／Bax）和异源（Bcl－2／Bax）二聚体对线粒体细胞凋亡途径进行调控。Bcl－2同源二聚体抑制细胞凋亡，Bax同源二聚体促进细胞凋亡。另外一个对细胞凋亡起重要调控作用的是caspase家族，它们是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。几乎所有的细胞凋亡都会有这些调控因子的参与，因此，可以通过对这些调控因子定性定量的检测，来反映细胞凋亡的程度。

本研究通过检测各组实验大鼠细胞凋亡途径中的Bcl－2、Bax和caspase－3表达情况发现，与对照组相比，糖尿病大鼠海马组织中的Bcl－2蛋白含量减少，而Bax蛋白含量升高，Bcl－2／Bax比值较Con组明显减少，可见DM组大鼠海马中异源（Bcl－2／Bax）二聚体和Bax同源二聚体的比例升高，更多的促进细胞凋亡的发生，同时通过IHC法对海马各区caspase－3检测发现，DM组caspase－3阳性表达明显增强，进一步验证了DM组凋亡发生的增多。而给予姜黄素处理DM组大鼠16周后，促凋亡的各指标表达都有下降，而抗凋亡蛋白Bcl－2水平升高，由此可见，姜黄素对DM组大鼠大脑海马神经元有抗凋亡的保护作用，这种保护作用可能与姜黄素的抗炎抗氧化作用相关［17－19］。

糖尿病脑病患者的认知功能障碍是多种因素参与的复杂病理过程，到目前为止，其作用机制也未完全阐明，治疗更是缺乏安全有效的药物，现在姜黄素对糖尿病的治疗作用已引起广泛重视，并被制成胶囊制剂试验其降糖效果，如果其降糖抗氧化等药理作用可以防治糖尿病脑病，将对糖尿病脑病患者的防治带来新的方向。我们的研究也证实姜黄素对STZ诱导的2型糖尿病模型大鼠海马有抗凋亡的保护作用，希望能更进一步研究其具体机制，为糖尿病脑病的研究和治疗带来新的依据，为姜黄素的治疗作用提供科学基础。

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