桂圆中儿茶素类成分提取及HPLC与红外光谱法分析

赵　丽，陈卫中，李　玲，张　楠，刘　新，韩　琴

（成都医学院公共卫生系，四川成都610083）

桂圆中儿茶素类成分提取及HPLC与红外光谱法分析

赵丽，陈卫中，李玲，张楠，刘新，韩琴*

（成都医学院公共卫生系，四川成都610083）

目的：研究了桂圆皮中儿茶素类成分超声波提取工艺，并对桂圆皮、肉及核中儿茶素类成分没食子酸（GA）、儿茶素（-C）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）进行定性、定量分析。方法：采用Box-Behnken Design实验考察甲醇体积分数、料液比和桂圆皮粉碎度三因素对桂圆皮中儿茶素类成分提取的影响，优化最佳提取工艺参数。用HPLC与红外光谱法对桂圆中儿茶素类成分进行分析和定量，确定其儿茶素类成分类型及含量。结果：最佳提取工艺参数为甲醇体积分数51%、料液比1∶30g/mL和桂圆皮粉碎度90目。桂圆皮儿茶素单体类型及含量：EC为0.786mg/g，ECG为0.33mg/g，-C为0.246mg/g，EGCG为0.163mg/g，GA为0.0387mg/g；桂圆核：EC为3.19mg/g，ECG为1.019mg/g，GA为0.385mg/g，EGCG为0.178mg/g。结论：红外光谱法证实：桂圆皮、核含有儿茶素类单体成分或其单体的聚合体。为桂圆儿茶素类成分有效开发提供一定的理论基础。

桂圆，儿茶素，响应面法，HPLC，红外光谱

桂圆（Dimocarpus longan Lour.），又称龙眼，归属无患子科，为亚热带水果，盛产于中国、泰国、中国台湾、印度和菲律宾等东南亚各国。在中国，人们不仅把桂圆作为营养丰富的水果来享用，而且其肉、核、皮以其安神，提高免疫力、降血压、缓解神经疼痛和肿胀等药效作为中药材被广泛使用[1-3]。研究发现，桂圆核甲醇提取物对小白鼠的记忆学习功能有明显的促进作用，对结肠癌320DM、SW480和HT-29细胞增殖有抑制作用，并诱导其细胞凋亡[4-5]。其皮高压辅助提取物对HepG2、A549和SGC7901肿瘤细胞株具有抗癌活性作用[6]。用100、250、400mg/kg剂量桂圆核提取物喂食小白鼠4周和13周时间，均未观察到对其毒副作用[7]。研究表明，桂圆皮、核的甲醇提取物中含有没食子酸、表儿茶素、没食子酸甲酯、柯里拉京、原花青素A、原花青素B2、老鹳草素、短叶苏木酚酸甲酯、诃黎勒鞣花酸、蛇莓苷、野桐酸、鞣花酸等多种抗氧化多酚类物质及槲皮素-3-鼠李糖、龙眼内酯和多糖-蛋白复合物等活性物质[2，8-10]。而其中的没食子酸、表儿茶素、原花青素A和原花青素B2等成分均属于黄烷-3-醇类化合物，该类化合物具有较好的生物学活性，已被证实有抗氧化活性、调节免疫、防癌、抗癌、抗菌、抗病毒、防辐射等功能。目前，现有文献中对桂圆皮、肉和核中黄烷-3-醇儿茶素类成分除了没食子酸（GA）、表儿茶素（EC）报道以外，其他成分缺乏相应的报道，尤其是其儿茶素（-C）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）成分。本研究通过响应面法优化出的桂圆皮中儿茶素类成分超声波提取最佳工艺参数，在最佳参数条件下对桂圆皮、肉和核中儿茶素类成分进行超声提取，采用HPLC法对其儿茶素类成分没食子酸（GA）、儿茶素（-C）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）进行定性、定量分析。同时，运用红外光谱技术为其含有儿茶素类成分提供光谱学依据，为桂圆儿茶素类成分有效开发提供理论参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

桂圆产地：成都泸县，分离果皮，果肉，果核，干燥，粉碎，分别过20、40、60、80和100目标准筛，4℃避光，贮存备用；没食子酸（GA）、儿茶素（-C）、表没食子儿茶素没食子酸（EGCG）、表儿茶素（EC）和表儿茶素没食子酸（ECG） 化学对照品，成都普瑞法科技有限公司，HPLC≥98%；甲醇色谱纯，Fisher Scientific，USA；溴化钾光谱纯，天津市光复精细化工研究所；磷酸分析纯，成都市科龙化工试剂厂；实验用水为去离子超纯水。

高效液相色谱仪日立（UV Detector：L-2400，pump：L-2130），日本株式会社日本高新技术那珂事业所；JY92-IIN型超声波细胞粉碎机20～50kHZ频率自动跟踪，6Φ变幅杆，宁波新芝生物科技有限公司；TJ270-30A型红外光谱仪天津拓普仪器有限公司；S04H型超声清洗机厦门仪器有限公司；BSA124S型电子天平北京赛多利斯系统有限公司。

1.2实验方法

1.2.1儿茶素类物质提取流程称取过筛桂圆皮、桂圆肉、桂圆核各1.0g→一定条件下超声波破碎提取儿茶素类物质→提取液离心、过滤→高效液相色谱定量。

1.2.2单因素实验

1.2.2.1料液比对儿茶素物质提取的影响称取过40目标准筛的桂圆皮1.0g，在超声波功率为200W、超声时间为30min、甲醇体积分数50%条件下，以儿茶素类物质总含量为目标，考察料液比1∶6、1∶12、1∶16、1∶20和1∶30（g/mL）对其儿茶素类物质提取的影响程度，确定响应面实验优化范围。

1.2.2.2粉碎度对儿茶素类物质提取的影响称取过40目标准筛的桂圆皮1.0g，在超声波功率为200W、超声时间为30min、甲醇体积分数50%、料液比1∶30条件下，以儿茶素类物质总含量为目标，考察桂圆皮粉碎度10、20、40、60和100目对其儿茶素类物质提取的影响程度，确定响应面实验优化范围。

1.2.2.3甲醇体积分数对儿茶素类物质提取的影响称取过60目标准筛的桂圆皮1.0g，在超声波功率为200W、超声时间为30min、料液比1∶30条件下，以儿茶素类物质总含量为目标，考察甲醇体积分数0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%对其儿茶素类物质提取的影响程度，确定响应面实验优化范围。

1.2.3响应面法优化桂圆皮儿茶素类物质超声波提取工艺在单因素的基础上，以超声波功率为200W、超声提取时间为30min作为固定因素，用Box-Behnken Design实验来考察甲醇体积分数、料液比和桂圆皮粉碎度三因素对桂圆皮儿茶素类物质提取影响程度，建立多元二次回归方程，在其基础上优化出最佳提取工艺条件参数。实验设计因素水平表如表1所示。

表1　因素与水平表Table.1　The factors and levels table

1.2.4HPLC标准曲线方程建立色谱条件：色谱柱Allsphere ODS-25U柱（4.6mm×250mm，5μm）；检测波长：λ=278nm；流速为1mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL。流动相A为含0.1%磷酸的甲醇溶液，流动相B为含0.1%磷酸的水溶液。流动相洗脱梯度：流动相A在0～5min内，从0%增加到30%；5～11min，从30%降低到18%；11～25min从18%增加到50%；25～27min，保持在50%不变[11]。

精确称取GA、-C、EGCG、EC、ECG的对照品各10mg，分别用甲醇定容至1mL，摇匀，制成浓度均为10mg/mL的标准品储备液。分别精密量取储备液各100μL，混合并定容至1mL，得到浓度为1000μg/mL的标准品混合液，稀释成62.5、125、250、500μg/mL四个浓度梯度标准品储备液，再过0.45μm滤膜，在色谱条件下进样10uL，以各组分质量（W）为横坐标，对应峰面积（A）为纵坐标作图，得到回归方程。

分别称取过90目标准筛的桂圆皮、肉、核各1g，在优化出的最佳超声波辅助提取工艺条件下，超声破碎提取儿茶素1次，经过3000r/min离心3min，取其上清液过0.45um滤膜，在给定色谱检测条件下进样各3次，分析比较桂圆皮、肉和核中儿茶素GA、-C、EGCG、EC、ECG单体类型及含量。

1.2.5桂圆皮、核红外光谱分析称取过90目标准筛的桂圆皮、核各2mg，分别与200mg溴化钾粉末混合研磨、压片，在4000～400cm-1波数范围内进行红外光谱扫描，通过其红外光谱图分析儿茶素类物质基团结构和类型。

2　结果与分析

2.1响应面实验结果与最佳提取工艺参数

2.1.1单因素实验

2.1.1.1料液比的影响从图1可以看出，桂圆皮中儿茶素类物质含量随着料液比的增大而呈现增高的趋势，说明甲醇提取溶剂体积的加大有利于儿茶素类物质的溶出，但考虑到样品浓缩时间、耗能成本及超声波细胞破碎仪变幅杆参数要求，所以选择料液比为1∶30。

图1　不同料液比对儿茶素类物质含量提取效果Fig.1　Effect of the ratio of solve to material on the contents of catechins

2.1.1.2粉碎度的影响图2显示，其儿茶素类物质含量随着粉碎度目数的增加而呈现增高趋势，当粉碎度目数增大到40目时，呈缓慢上升趋势，这可能是由于桂圆皮粉碎过细，溶出的儿茶素类物质由于桂圆皮粉末静电作用而被吸附，进而不利于其溶入提取溶液中，故选择粉碎度为60目。

图2　不同粉碎度对儿茶素类物质含量提取效果Fig.2　Effect of the smash degree on the on the contents of catechins

2.1.1.3甲醇体积分数的影响图3、图4表明，桂圆皮中儿茶素类物质在溶于10%与50%这两个甲醇体积分数时，其含量相对的最高。控制好甲醇体积分数可有助于其儿茶素类单体成分物质的提取。当甲醇体积分数为10%时，虽然桂圆皮中儿茶素类物质总体含量较高，但是其EC成分含量较高，相比于甲醇体积分数为50%时，其提取物中其他儿茶素单体含量较少，且只检测到4种儿茶素单体成分，所以选择甲醇体积分数为50%。

图3　不同甲醇体积分数对儿茶素类物质含量提取效果Fig.3　Effect of the concentrations of methyl alcohol on the contents of catechins

2.1.2Box-Behnken Design实验组合及结果以Box-Behnken Design实验方案为基础，对考察因素和其水平进行设计，共17组实验条件组合，以HPLC法检测桂圆皮中儿茶素类物质总含量作为响应值，得到17组实验结果，见表2。

2.1.3回归方程构建及拟合度分析在Box-Behnken Design实验结果基础上构建甲醇体积分数、料液比和桂圆皮粉碎度三因素对桂圆皮儿茶素类物质提取工艺参数的多元二次方程模型，模型方差及拟合结果见表3。回归模型F检验显著（p＜0.0001）；失拟项F检验在α=0.05水平不显著（p＞0.05），调整后R2=0.9860，预测R2=0.9397，信噪比=44.313，表明该模型拟合较好，可用于桂圆皮中儿茶素类物质提取条件的参数评价和优化。

多元二次方程如下：

Y儿茶素总含量（mg/g）=1.48+0.026A+0.032B+3.019×10-3C-0.021AB-3.275×10-3AC+8.712×10-3BC-0.049A2-0.013B2-5.509×10-3C2

2.1.4响应面分析及最佳提取条件参数优化当检验水准取α=0.05时，AC对桂圆皮儿茶素物质总量提取呈不显著影响（p=0.1810），所以对其交互作用不做分析。

如图5所示，当C因素（粉碎度）为93.1476目时，儿茶素类物质的含量随着A因素（甲醇体积分数）和B因素（料液比）的增大而增高，直到甲醇体积分数为51.0432%时，其儿茶素类物质的含量达到最大值1.51（mg/g），之后随着甲醇体积分数的升高而出现下降趋势。因此，控制好甲醇体积分数有助于桂圆皮中儿茶素含量的提取；当A因素（甲醇体积分数）为51.0432%时，其儿茶素类物质含量随着B因素（料液比）的增加而呈现明显增加的趋势（p＜0.0001），而C因素（粉碎度）对其儿茶素类物质的含量提取影响程度较小，呈现平缓上升趋势。

表2　Box-Behnken Design实验设计及结果Table.2　Box-Behnken Design and results

表3　方差分析及显著性检验Table.3　Variance analysis and significance tests

2.1.5优化最佳提取条件参数组合及验证在超声波功率为200W、超声时间为30min条件下，在多元二次回归方程基础上以最大儿茶素类物质含量1.51（mg/g）为目标值，得到超声波辅助提取桂圆皮中儿茶素类物质最佳提取工艺参数组合：甲醇体积分数51.0432%、料液比1∶29.9999g/mL和桂圆皮粉碎度93.1476目。为了便于实际应用对相关参数做了调整为：甲醇体积分数51%、料液比1∶30g/mL和桂圆皮粉碎度90目。验证实验，最佳条件下的儿茶素物质总含量为1.48（mg/g），与模型预测值1.51（mg/g）接近。

2.2桂圆中儿茶素类成分HPLC分析

按1.2.4方法，分别对不同浓度的GA、-C、EGCG、EC、ECG对照品进行线性拟合，得到方程如表4所示。

对照品混合液5种单体在给定的色谱条件下分离情况良好，Rf＞1.2，可用来对样品中的5种儿茶素单体进行成分分析和定量，其谱图如图6所示。

图6　儿茶素类对照品（a）与桂圆皮（b）、桂圆肉（c）和桂圆核（d）中的儿茶素类提取物的色谱图Fig.6　Graphs of HPLC separation for catechins standers（a）and other graphs for peel（b），flesh（c）and seed（d）of longan，respectively

由图6可以看出，桂圆皮中除了含有所检测的5种单体外，还有很多其他植物活性物质，其物质有待于进一步研究和定量。桂圆肉在本次检测中只含有微量的儿茶素单体GA，故不用红外光谱法来对其儿茶类成分进行分析。桂圆核除-C没有检测出外，其他4种单体都被很好的分离出，而且其含量均高于桂圆皮中对应的单体含量，见表5。

表5　桂圆皮与桂圆核中儿茶素单体类型及其含量Table.5　The styles and contents of catechins for peel and seed of longan

由表5可知，桂圆皮与桂圆核中儿茶素5种单体中EC含量最高，桂圆皮中儿茶素单体含量由高向低为：EC为0.786mg/g，ECG为0.33mg/g，-C为0.246mg/g，EGCG为0.163mg/g，GA为0.0387mg/g；桂圆核中儿茶素单体含量由高向低为：EC为3.19mg/g，ECG为1.019mg/g，GA为0.385mg/g，EGCG为0.178mg/g。

2.3桂圆皮与桂圆核儿茶素类物质红外光谱分析

由于1400～700cm-1波数为其基团指纹区，且成分复杂，故将1800～700cm-1区域红外光谱进行二阶微分计算，使光谱吸收峰信号增强，以便相对完全反映桂圆皮和桂圆核所含成分[12]。

图7显示，桂圆皮与桂圆核光谱中吸收峰均含有酚类分子-O-H的伸缩振动吸收峰（3356.00cm-1）、-O-H弯曲振动与醚上的-C-O伸缩振动吸收峰（1325～1341cm-1，1226～1202cm-1）、-C=O伸缩振动吸收峰（1660～1690cm-1）、-C=C伸缩振动吸收峰（1655～1604cm-1）、CH2变形振动吸收峰（1332.00cm-1）、苯环伸缩振动吸收峰（1619、1510、1459cm-1）和二取代苯上的=C-H（782～764cm-1）变形振动吸收峰，与儿茶素类物质骨结构振动架一致而形成[1，12-14]。说明桂圆皮、核中含有儿茶素类单体成分或其单体的聚合体。

图7　桂圆皮（a）与桂圆核（b）红外光谱图Fig.7　FTIR spectra of peel（a）and seed（b）of longan

研究显示，儿茶素类对照品GA的特征吸收峰波数为1702cm-1；-C的特征吸收峰波数为1643、1518、819、780、765cm-1；EC的特征吸收峰波数为1518、1469、1112、796cm-1；由于ECG、EGCG分子结构中有酯基存在，故在1681cm-1和1692cm-1处各有一个特征吸收峰[13，15]。

与儿茶素类对照品特征峰对比，发现其特征峰在桂圆皮、核的红外光谱中均能找出。桂圆皮二阶导数光谱中具有GA特征吸收峰（1702cm-1）；-C特征吸收峰（1647、1511、818、781、764cm-1）；EC特征吸收峰（1511、1468、1111、795cm-1）；EGCG特征吸收峰（1693cm-1）；ECG特征吸收峰（1686cm-1）。桂圆核二阶导数光谱中具有GA特征吸收峰（1707cm-1）；-C特征吸收峰（1647、1510、819、779、763cm-1）；EC特征吸收峰（1510、1468、1112、792cm-1）；EGCG特征吸收峰（1691cm-1）；ECG特征吸收峰（1685cm-1）。进一步证实了：桂圆皮中和桂圆核中存在儿茶素类物质的单体或聚合体成分。从桂圆核光谱图上可以看出其核应该还有-C成分，而在HPLC图中未发现，可能是由于桂圆核中-C与EC聚合成多聚体原花青素的缘故，故在桂圆核红外光谱图可以发现代表原花青素二聚体的特征吸收峰（1520、1150、1139cm-1）[13]。

3　结论

应用响应面法对桂圆皮中儿茶素类物质超声波提取工艺进行优化及多元二次模型的构建。在超声波功率为200W、超声时间为30min条件下，桂圆皮中儿茶素超声波最佳提取工艺参数为：甲醇体积分数51%、料液比1∶30g/mL和桂圆皮粉碎度90目。在最佳提取条件下，分别对桂圆皮、肉及核的儿茶素类物质进行提取，其提取物通过HPLC法来定量分析，得出桂圆皮中EC为0.786mg/g，ECG为0.33mg/g，-C为0.246mg/g，EGCG为0.163mg/g，GA为0.0387mg/g；桂圆核中EC为3.19mg/g，ECG为1.019mg/g，GA为0.385mg/g，EGCG为0.178mg/g。通过红外光谱法证实了桂圆皮与桂圆核存在儿茶素类物质的单体或聚合体，且含有大量的-C与EC聚合物原花青素多聚体成分，为其黄烷-3-醇类儿茶素类及原花青素类成分有效开发提供光谱学依据。

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Study on extraction and determination of contents of catechins by the methods of HPLC and FTIR spectroscopy from longan

ZHAO Li，CHEN Wei-zhong，LI Ling，ZHANG Nan，LIU Xin，HAN Qin*
（Department of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China）

Objective：To study the ultrasonic-assisted extraction of catechins from longan and identification and quantification of the contents of catechins，including gallic acid，catechin，epigallocatechin-gallate，epicatechin and epicatechin-gallate，were studied from peel，flesh and seed of longan.Methods：Box-Behnken design（BBD）was applied to evaluate the effects of three independent variables（methanol concentrations，the ratio of solvent to material and the smash degree）on total catechins of of longan peel.Identification and quantification of the contents of catechins were investigated by the methods of HPLC and FTIR spectroscopy in longan. Results：The results showed that the optimal conditions were as follows：methanol concentrations were 51%，the ratio of solvent to material was 1∶30g/mL and the smash degree was 90mu with the ultrasonic extraction method. The contents of catechins showed that epicatechin was 0.786mg/g，epicatechin-gallate was 0.33mg/g，catechin was 0.246mg/g，epigallocatechin-gallate was 0.163mg/g and gallic acid was 0.0387mg/g in longan peel and other results showed that epicatechin was 3.19mg/g，epicatechin-gallate was 1.019mg/g，gallic acid was 0.385mg/g and epigallocatechin-gallate was 0.178mg/g in longan seed，respectively.Conclusion：It was confirmed that different structural units of catechins and polymeric compounds by means of FTIR spectroscopy in longan.These result set the theoretical foundation for the development and utilization of catechins from longan.

longan；catechins；response surface methodology；HPLC analysis；FTIR spectroscopy

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0126-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.018

2014－05－08

赵丽（1990-），女，本科生，研究方向：植物中活性物质提取。

韩琴（1982-），女，硕士，实验师，主要从事预防医学实验教学和营养保健与免疫方面的研究。

四川省大学生创新训练计划项目（201313705014）；成都医学院学科建设项目（CYXK2012010）；成都医学院自然科学基金（CYZ11-019）。