大叶苦丁茶抗氧化成分的提取及活性的比较研究

金亚香，孙　晶，李洪军

（吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）

大叶苦丁茶抗氧化成分的提取及活性的比较研究

金亚香，孙晶，李洪军*

（吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）

大叶苦丁茶是一种传统的食药两用茶饮品，含有多种活性成分，为了提高大叶苦丁茶的利用效率，采用85%乙醇提取，并依次分别用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行液-液萃取，分别得到石油醚组分（PS）、乙酸乙酯组分（PA）、氯仿组分（PC）、正丁醇组分（PB），和剩余的水溶性部分（PW）。随后采用化学方法对各组分进行定性和定量鉴定，并研究了各组分体外对DPPH自由基的清除作用，和体内对脂质过氧化小鼠血清中SOD和MDA的影响。结果表明，乙酸乙酯萃取组分主要为酚类和黄酮类，氯仿萃取组分中主要为蛋白质和生物碱类，正丁醇萃取组分主要为蛋白质类物质，而水相主要含有蛋白质和糖类。PA对DPPH自由基清除作用最好，当其浓度为100mg/mL时，最高清除率可达到50%。其次是PW、PC和PB。此外体内抗氧化实验表明PA和PW能够显著提高小鼠血清中SOD活性，降低MDA产量，与阳性对照组治疗效果接近，与模型组有显著差异。

大叶苦丁茶，抗氧化活性，分级萃取

大叶苦丁茶（Ilex Kudingcha C.J.Tsing），又名富丁茶，原植物来源为大叶冬青及苦丁茶冬青，为冬青科常绿乔木。因其生长于山峦溪涧之间，且冲泡后具有先苦后甘的口感而得名[1]。它既可以作为饮品，又具有神奇的药用价值。早在明代李时珍所著《本草纲目》中便有记载其主治：煮饮，止渴、明目、除烦，令人不唾，消痰利水[2]。大叶苦丁茶中的主要化学成分包括黄酮类、多酚类、三萜类、有机酸、氨基酸类和多种微量元素、维生素类[3-4]等。这些活性成分单独、或是联合发挥多种药理活性，包括清凉解毒、降脂、降压、抑菌、抗氧化、减肥等功效[5-6]。研究表明，从大叶冬青苦丁茶中分离的多酚、多糖、生物碱、黄酮类生物分子都具有明显的抗氧化性能，尤其是黄酮类和多酚类可以在食物油中溶解，所以可以被用作油脂、食品等的抗氧化剂[7]。食用后，也可以延缓衰老，清除体内的自由基。然而大叶苦丁茶中的主要活性成分极性等差异较大，所以采用单一溶剂提取效率不高，利用有机溶剂分级萃取植物中不同极性组分的方法已被应用于玉竹降糖组分的提取中，这种方法简单、快速，能够提高植物的利用率[8]。所以本文亦采用有机溶剂对大叶苦丁茶粗提物进行分级萃取，并分别对各种提取物体内和体外的抗氧化活性进行了评价，对大叶苦丁茶的综合开发利用有一定意义。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大叶苦丁茶原料产自浙江绍兴的大叶冬青苦丁茶；实验动物昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，合格证号为SCXK-（吉）2010-0003，由长春生物制品研究所提供；DPPH、碘化铋钾试剂、双缩脲试剂、茚三酮试剂、香草醛-硫酸试剂等购自北京化工厂；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。

DHP-908型电热恒温培养箱上海一恒仪器有限公司；UV-3150型紫外可见近红外分光光度计日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1大叶苦丁茶主要成分的提取准确称取100g干燥的大叶苦丁茶，用小型机械粉碎机粉碎、研钵研磨后过60目筛，提取工艺为：85%乙醇∶茶（v/w）为10∶1，回流提取2次，合并滤液，减压浓缩，蒸干得粗提物。然后该提取物用100mL蒸馏水重悬，并依次分别用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行液-液萃取，回收溶剂，分别得到石油醚组分（PS）、乙酸乙酯组分（PA）、氯仿组分（PC）、正丁醇组分（PB）和剩余的水溶性部分（PW），将各组分中溶剂充分挥发或蒸干，重复三次[8]。样品冷冻干燥，备用。

1.2.2大叶苦丁茶成分分析依照王曦[9]方法定性分析各种提取物中化学成分的种类，初步确定其中可能的活性物质。检测是否存在氨基酸、多肽、蛋白质、还原糖、糖类、鞣酸、酚类、生物碱类、甾醇类、环烯醚萜类、有机酸、油、挥发油、蒽醌类、黄酮类、香豆素和内酯类化合物。随后根据定性分析结果按照孙文基[10]，采用比色法对可能存在的物质分别进行定量测定。

1.2.3提取物对DPPH自由基的清除作用1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）是一种稳定的自由基。将DPPH以50%乙醇配制成25μmol/L的溶液，反应体系为2.0mL一定浓度提取物和2.0mL DPPH，空白组以2.0mL 50%乙醇代替DPPH，对照为2.0mL 50%乙醇和2.0mL DPPH，各组反应液在室温下静置30min后测定517nm处的吸光度值。实验结果以清除率表示，计算公式如下[11]：

清除率I（%）=[1-（A样品-A空白）/A对照]×100

式中：A样品为样品溶液吸光度值，A空白和A对照分别为空白组和对照组吸光度值。采用PS、PA、PC、PB、PW分别代表石油醚组、乙酸乙酯组、氯仿组、正丁醇组和剩余的水提物组；黄酮苷和虫草多糖为阳性对照组。

1.2.4大叶苦丁茶提取物体内抗氧化活性的研究将70只小鼠随机分成7组，每组10只，雌雄各半。分为空白组、模型组、阳性对照组、PA组、PC组、PB组、PW组。除空白组每天皮下注射生理盐水外，其余各组小鼠每天皮下注射D-半乳糖，给药剂量为125mg/kg，连续45d。建模同时灌胃给药。空白组和模型组每日口服生理盐水，阳性对照组小鼠给予100mg/（kg·d）维生素E，实验组小鼠分别给予400mg/（kg·d）的PA、PC、PB或PW提取物。末次给药后，眼眶静脉丛取血，3500r/min离心10min，取血清，-20℃保存，并采用试剂盒测定血清中SOD和MDA活力[12]。

2　结果与分析

2.1大叶苦丁茶提取物制备

100g干燥的大叶苦丁茶用85%的乙醇提取后，得到（12.4±1.8）g粗提物，用100mL蒸馏水重悬，随后根据大叶苦丁茶中组分的极性差异，分别采用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇对粗提物进行萃取，以单位质量苦丁茶原料中得到的提取物质量计算提取率，结果如表1所示。其中石油醚萃取物提取率最低，乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物提取率最高，说明粗提物中非极性物质较少，而极性大的物质更容易被85%乙醇溶液提取出来，相对于传统的氯仿等单一溶剂提取，对大叶苦丁茶的利用率更高。

表1　大叶苦丁茶有效成分提取结果Table.1　Extraction result of the main components extracted from Ilex Kudingcha C.J.Tsing

表2　粗提物化学成分初步分析结果Table.2　Preliminary chemical analysis results of crude extracts

2.2大叶苦丁茶提取物中成分鉴别

由于每种化学物质均可以通过颜色反应进行鉴别，采用了多种方法鉴别未知组分的种类，实验结果如表2所示。从表2中可以看出，石油醚萃取组分中不含有检测的几种物质，可能是由于石油醚非极性强，主要能溶解的是脂质类物质。此外，乙酸乙酯萃取组分主要为酚类和黄酮类，氯仿萃取组分中主要为蛋白质和生物碱类，正丁醇萃取组分主要为蛋白质类物质，而水相主要含有蛋白质和糖类。通过比色法测定PA、PC、PB和PW中各种物质的含量，结果显示PA中总多酚含量为0.5%，总黄酮含量为0.6%。PC中蛋白质含量为3.5%，总生物碱含量为0.6%，PB中蛋白质含量为12.4%，PW中蛋白质含量为4.8%，多糖含量为1.2%。

2.3大叶苦丁茶各组分的抗氧化活性比较

2.3.1对DPPH自由基的清除作用大叶苦丁茶分级提取物对DPPH自由基的清除作用如图1所示。五种提取物中，PS无抗氧化能力，而PA、PC、PB、PW都具有一定的清除DPPH自由基作用，且都具有剂量依赖性，随着给药浓度的逐渐增加，其对DPPH自由基的清除能力也逐渐增强。PA对DPPH自由基清除作用最好，当其浓度为100mg/mL时，最高清除率可达到50%。其次是PW、PC和PB。PB中含有较多含量的蛋白质，在经过氯仿和正丁醇萃取后多变性，较难维持抗氧化活性。与黄酮苷、虫草多糖对照品的抗氧化活性比较可以看出，PA和黄酮苷对DPPH自由基的清除作用接近，而PW和虫草多糖具有相似的抗氧化结果，可以推测，大叶苦丁茶中具有抗氧化作用的物质可能是黄酮和多糖类，但是PA萃取物中的多酚成分是否也同样具有抗氧化活性，有待进一步研究。

2.3.2大叶苦丁茶提取物体内抗氧化活性的研究SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。而（MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一。脂质过氧化能够破坏体内多种蛋白质，其增强被认为是机体发生多种疾病的诱因[13]。D-半乳糖能导致小鼠发生脂质过氧化，经过维生素E、PA、PC、PB、PW治疗后，各实验组小鼠血清中SOD和MDA活性如图2所示。从图2中可以看出，D-半乳糖导致模型组小鼠体内SOD活性明显降低，而MDA产量增加，说明小鼠体内发生过氧化，建模成功。通过PA、PC、PB、PW的治疗后，过氧化得到了有效控制，尤其是PA组和PW组，与阳性对照组治疗效果接近，与模型组有显著差异（p＜0.01），这与体外的结果相一致。PC和PB治疗效果稍差。

图2　大叶苦丁茶提取物对小鼠血清中SOD和MDA活力的影响Fig.2　Effect of Kudingcha extracts on SOD and MDA activity in mice

3　结论

大叶苦丁茶以其食药两用，而一直被用作传统的保健茶饮品。其活性成分包括多酚类、多糖类、黄酮类及多种微量元素。但是传统的提取方法繁复，原料利用效率低。采用不同极性的溶剂分级提取，既降低了成本，也提高了原料的利用率。此外，还比较研究了不同的提取物体内和体外的抗氧化活性，结果表明乙酸乙酯、氯仿、正丁醇和水萃取组分均具有一定的抗氧化活性，通过成分鉴定，发现乙酸乙酯萃取物中含有多酚和黄酮类物质，而氯仿萃取物中含有蛋白质类和生物碱，水提物中含有多糖和蛋白质。本文为大叶苦丁茶在工业上的应用提供了研究基础，具有很广阔的应用前景。

[1]陈杖洲.中国苦丁茶良种——参味型大叶种[J].广西热带农业，2002（4）：12-14.

[2]易帆，彭勇，许利嘉，等.大叶苦丁茶的研究进展[J].中国现代中药，2013（8）：710-717.

[3]何炜，屠幼英，胡丹竹，等.浙江省大叶冬青苦丁茶化学成分的分析[J].浙江农业科学，2006（1）：44-46.

[4]陈薇，王恒山，邓彦兴，等.大叶苦丁茶成分提取及抗氧化性能研究[J].天然产物研究与开发，2002（4）：24-28.

[5]庄辉发.大叶冬青苦丁茶的研究现状与发展前景[J].热带农业科学，2009（8）：51-54.

[6]赵天湖，范嘉龙，闫冬，等.大叶冬青苦丁茶多糖提取、纯化与抗氧化活性研究[J].作物研究，2011（1）：56-60.

[7]陈薇，王恒山，黄世稳，等.大叶苦丁茶抗氧化成分及抗氧化性能研究（Ⅰ）[J].广西植物，2002（5）：463-466，443.

[8]Yafei Deng，Kai He，Xiaoli Ye，et al.Saponin rich fractions from Polygonatum odoratum（Mill.）Druce with more potential hypoglycemiceffects[J].JournalofEthnopharmacology，2012（141）：228-233.

[9]王曦.鼠妇提取物镇痛片剂的研究[D].长春：吉林大学，2010.

[10]孙文基，谢世昌.天然药物成分定量分析[M].北京：中国医药科技出版社，2002：513-544.

[11]Hu M，Skibsted L H.Antioxidative capacity of rhizome extract and rhizome knot extract of edible lotus（Nelumbo nuficera）[J].Food Chemistry，2002，76（3）：327-333.

[12]钟灵，王振富，文德鉴.黄芪多糖抗衰老作用的实验研究[J].中国应用生理学杂志，2013（4）：350-352.

[13]Wang B-S，Lee C P，Chen Z-T，et al.Comparison of the hepatoprotective activity between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis[J].Journal of Functional Foods，2012，4（2）：489-495.

Comparison of the antioxidant activity of different extracts from Ilex Kudingcha C.J.Tsing

JIN Ya-xiang，SUN Jing，LI Hong-jun*
（China-Japan Union Hospital of Jilin University，Jilin University，Changchun 130033，China）

Ilex Kudingcha C.J.Tsing was a traditional tea drinks both edible and medicinal，containing a variety of active components.In order to improve the extraction efficiency of kudingcha，85%ethanol was used as solvent，and were followed by liquid-liquid extraction with equal volume of petroleum ether，ethyl acetate，chloroform and n-butanol，respectively.The petroleum ether component（PS），the acetate component（PA），chloroform component（PC），n-butanol component（PB）and the remaining portion of the water-soluble（PW）were obtained.They were identified by chemical methods and the anitoxidant activity of which were investigated both in vivo and in vitro.Results showed that the main component of ethyl acetate were phenols and flavonoids，chloroform extraction components were protein and alkaloids，n-butanol extract were protein substances，and the aqueous phase containing mainly protein and sugar，respectively.PA could significantly scavenge the DPPH free radical when the concentration was 100mg/mL，the highest removal rate was 50% followed by PW，PC and PB.In addition，PA and PW could significantly increase the activity of SOD，decreased the production of MDA in serum in vivo.

Ilex Kudingcha C.J.Tsing；antioxidant activity；fractional extraction

TS272.5

A

1002-0306（2015）04-0151-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.024

2014－05－26

金亚香（1962-），女，博士，护师，研究方向：康复保健与活性物质研究。

李洪军（1960-），男，博士，教授，研究方向：康复保健与活性物质研究。