杨树皮类脂对小白鼠单核—巨噬细胞吞噬功能的影响

赵英娜 杨 平 杨灵芝 贾红梅 陈申秒 （山东滨州沃华生物工程有限公司 256606）

杨树皮类脂对小白鼠单核—巨噬细胞吞噬功能的影响

赵英娜 杨 平 杨灵芝 贾红梅 陈申秒 （山东滨州沃华生物工程有限公司 256606）

本试验以作为免疫增强剂及佐剂的杨树皮类脂采用碳颗粒廓清法给小白鼠灌胃来研究杨树皮类脂对小白鼠单核—巨噬细胞吞噬功能的影响，试验给16只小白鼠注射刚果红染料和灌食5、10、20倍稀释的杨树皮类脂溶液，通过对小鼠单核-巨噬细胞吞噬刚果红染料的吞噬速率进行t检验。结果表明，5倍稀释的杨树皮类脂抑制小白鼠单核巨噬细胞的吞噬功能和生理盐水组间差异不显著(P＞0.050)；10、20倍稀释的杨树皮类脂溶液和生理盐水组间差异极显著(P＜0.01)地提高巨噬细胞的吞噬功能；试验证明杨树皮类脂在促进小白鼠单核—巨噬细胞吞噬功能方面有较显著的作用，从而为杨树皮类脂用于免疫增强剂提供了一定的理论依据。

杨树皮类脂 佐剂 单核—巨噬细胞 碳颗粒廓清法

杨树皮类脂(Poplar Bark Lipoid，PBL)系从杨树皮中提取的一种生物活性物质，具有高度的生物学活性，含有大量的多糖类、有机酸、甾醇、甙类、黄酮类物质。这些物质在动物体内协调统一，大大提高动物体的免疫机能。研究表明，PBL在畜牧兽医、医药方面都有着广泛的应用前景。杨树皮类脂可作为生物活性添加剂用于饲料添加剂方面，能够提高肉用畜禽体重，替代部分维生素，具有较强的抗热应激作用，可提高产蛋量等功能。在预防、治疗畜禽疾病方面，由于杨树皮类脂含有大量的不饱和脂肪酸，具有类似维生素pp(维生素B3，烟碱胺，烟酰胺)的生物活性。

1 材料

1.1 试验动物 从“有实验动物繁殖许可证”的单位购进的合格实验小白鼠，体重18-22g，12只。

1.2 主要试剂 刚果红：取刚果红2g加蒸馏水至100ml；

1:5稀释的刚果红：取刚果红1ml生理盐水4ml；肝素液：取0.02g肝素钠加蒸馏水至100ml；0.1%Na2CO3：取0.1g Na2CO3加蒸馏水100ml；生理盐水。

1.3 仪器设备 721型分光光度计(上海精密仪器有限公司220V、50HZ、120W)，高压均质机(上海东华高压均质机厂)，电子天平，灌胃导管数根、移液器、注射器及解剖用具一套、5ml小瓶数个。

1.4 杨树皮类脂 由本实验室制备：取新鲜杨树皮烘干粉碎，采用乙醚抽提法进行抽提，粗提物再用乙醚抽提，得到类脂，类脂经过热过滤、搅拌常温密封保存备用。纯杨树皮类脂分别做5、10、20倍稀释。

2 试验方法

2.1 碳颗粒廓清法 取16只小老鼠随机分为4组，即PBL1组、PBL2组、PBL3组和生理盐水组(对照组)，每组4只，各组分别灌胃5、10、20倍稀释的PBL溶液和生理盐水，每鼠每天灌胃0.5ml，连续灌胃10d，最后一次给药后次日，给小鼠编号称体重并记录。每只小白鼠从尾静脉注射用生理盐水1:5稀释的刚果红染料0.2ml(0.05～0.1ml/ 10g)。分别在注后3、10min用吸管(先用肝素液湿润)从眶后静脉丛采血一次，采40µl溶于4ml 0.1%的Na2CO3溶液中摇匀，置722型分光光度计在波长600～680nm下比色(该试验采用650nm)，测定光密度(OD)。最后将小鼠脊椎脱臼处死，分别取肝、脾重并记录。

2.2 结果判定 该试验的原理：单核—巨噬细胞系统是机体最重要的防御系统，它具有强大而迅速的吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性异物的能力，并能迅速清除体内自身产生的某些有害物质，当静脉注入特定大小的惰性碳粒后，它即可被单核—巨噬细胞迅速吞噬而从血液中廓清，因此，借助测定血液中碳粒的小时速度来反映单核—巨噬细胞系统吞噬异物的能力。（1）吞噬速率：在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系，即吞噬速度与血碳浓度呈正比，而与已吞噬的碳颗粒量成反比，以血碳浓度对数值为纵坐标，时间为横坐标，两者呈线性关系，此直线斜率即为吞噬速率。其计算公式为：K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)，式中K为吞噬速率；OD1、OD2分别为注射刚果红染料后3、10min所取血样的光密度值；t2-t1为取两血样的时间差，为7min。一般以±SE表示各组K值，进行组间t检验，比较差异的显著性。（2）校正的吞噬指数：计算公式如下：a=K1/3×体重/(重+脾重)，式中a代表吞噬指数，反映了每单位组织重量的吞噬活性；K为吞噬速率。

3 结果

表1 小白鼠注射刚果红后3min吸收度（A）

表2 小白鼠注射刚果红后10min吸收度测定（A）

表3 各组的吞噬速率K值

表4 各组校正的吞噬指数（a）

表5 小老鼠处死后体重和肝、脾重 （g）

4 讨论

4.1 显著性比较 通过比较吞噬速率K数值表中X值的可知：5倍稀释组中的x=-0.570＜-0.2367(生理盐水组)，故5倍稀释组所含类脂的剂量可以抑制小白鼠单核—巨噬细胞系统吞噬异物的能力；10倍稀释组中的x=0.0139＞-0.2367说明10倍稀释组所含类脂的剂量能够促进小白鼠单核-巨噬细胞系统吞噬异物的能力；20倍稀释组中的x=0.0793＞-0.2367说明20倍稀释组所含类脂的剂量可以促进小白鼠单核—巨噬细胞系统吞噬异物的能力；t检验：通过t检验来反映各稀释组间差异的显著性。5倍稀释组与生理盐水组：则随机误差的概率P＞0.05，推断两总体均数差异不显著；10倍稀释组与生理盐水组：则随机误差的概率P＜0.01，推断两总体均数差异极显著；20倍稀释组与生理盐水组则随机误差的概率P＜0.01，推断两总体均数差异极显著；5倍稀释组与10倍稀释组则随机误差的概率0.01＜ P＜0.05，推断两总体均数差异显著；5倍稀释组与20倍稀释组：则随机误差的概率0.01＜P＜0.05，推断两总体均数差异显著；10倍稀释组与20倍稀释组则随机误差的概率0.01＜P＜ 0.05，推断两总体均数差异显著；通过比较各组的吞噬速率K值表中x大小和t检验得出最后结论：5倍稀释的杨树皮类脂抑制小白鼠单核巨噬细胞的吞噬功能但差异不显著；不适合实际生产，因为浪费原料和经费。10倍稀释的杨树皮类脂促进小白鼠单核—巨噬细胞的吞噬功能而且差异极显著；效果比较好适宜实际生产。20倍稀释的杨树皮类脂亦促进小白鼠单核—巨噬细胞的吞噬功能而且差异极显著；效果比10倍稀释的杨树皮类脂更好，相对来说更利于节省原材料节约开支，比较适宜实际生产。会为今后的自然资源合理利用，为下一步的兽用生物制品的研制开辟新的途径，更会具有良好的社会效益与经济效益。PBL中的多种活性成分共同作用能使小鼠单核-巨噬细胞的吞噬活性增强，从而提高了小鼠机体的免疫力。

4.2 误差分析 各组数值的SE可以看出，本试验存在一定的误差，这将影响试验结果的准确性。（1）表5中由于条件有限，用于实验的小白鼠初始态生长发育不太一致，体重有一定的差异，其抵抗力也将有一定的差异，将会引起一定的误差。（2）刚果红染料的最佳稀释浓度及使用的最佳剂量是一个较难把握的环节，而且在使用过程中需不需要过滤也有待证实。（3）小白鼠尾静脉注射及眶下静脉丛采血的不够熟练也将引起试验误差。（4）10、20倍稀释类脂组能极显著促进单核—巨噬细胞的吞噬活性，而5倍稀释类脂组抑制单核-巨噬细胞的吞噬活性但作用不显著。这主要是由于中草药具有双向调节性，它对吞噬细胞功能的影响因剂量不同而改变，小剂量有促进作用，随着剂量的增加，出现减弱甚至抑制作用。所以，PBL对小鼠单核—巨噬细胞吞噬功能的影响还有待于进一步的试验研究。

4.3 类脂的免疫功能分析 （1）从试验结果可以看出，给小鼠注射适宜稀释倍数的类脂后机体的免疫功能有一定的增强。（2）杨树皮类脂在影响机体免疫功能方面具有较为显著的效果。据张兴晓等报道以杨树皮类脂为免疫增强剂研制鸡传染性鼻炎灭活疫苗，不但可以避免现有疫苗所存在的应激性大、不易保存、有残留等缺点，而且在紧急预防与治疗方面具有显著的效果。因此，以杨树皮类脂为免疫佐剂制备禽用类脂疫苗对机体具有增强免疫效果。（3）树皮类脂是从杨树皮中提取的一种纯天然物质，具有高度的生物学活性，在畜牧兽医学领域：①类脂可提高蛋鸡的产蛋率(可提高4%～7%)；②降低鸡群对冷、热、惊吓、停电、断水等的应激性。③提高肉鸡品质，增加体重(可提高4%～7%)。④代替部分多维素。⑤具有抗大肠杆菌、球虫、沙门氏菌等病原菌功能。将它作为免疫佐剂，既可保持抗原特性，又能成为良好的免疫增强剂和刺激剂，这是其它常规的佐剂如羊毛脂、弗氏佐剂等无可比拟的。

5 结语

（1）山东滨州博莱威生物技术有限公司在国际上首次杨树皮类脂用于畜禽用疫苗作为免疫增强剂并获得成功，所研制成功的禽用类脂系列疫苗产品包括复合新城疫、传支、减蛋、传染性鼻炎等。（2）将杨树皮类脂与吸附剂按一定比例混合，制成含10%的类脂制剂，在应用时与饲料均匀混合，使料中纯类脂终浓度为0.2%，然后在病鸡群中应用。结果表明，杨树皮类脂对肉鸡大肠杆菌有明显的疗效。在杨树皮类脂的抑菌实验中研究也发现，无论是纯杨树皮类脂还是50%的类脂油溶液均有明显的抑菌作用。另外在治疗鸡球虫病时，类脂不能够阻碍鸡球虫在肠道内生长发育，但可降低鸡的死亡率20%。（3）PBL作为一种新型的中草药免疫调节剂在增强机体免疫力方面的研究与应用刚刚起步，近年来得到越来越多的关注。本次试验肯定了PBL在促进小白鼠单核-巨噬细胞吞噬功能方面有较显著的作用，从而为PBL用于免疫增强剂提供了一定的理论依据。但是由于PBL作为一种中草药其成分复杂，并且发挥作用时又常常是各种成分协同进行作用，因此，对PBL能够提高小白鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响还有待于进一步的研究。

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