用星点设计-效应面法优化锥栗总黄酮超声提取工艺

朱 思，牛广俊，苏素娇，李 娜，陈诗强，陈 亮，梁一池

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

用星点设计-效应面法优化锥栗总黄酮超声提取工艺

朱 思，牛广俊，苏素娇，李 娜，陈诗强，陈 亮，梁一池

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

为了优选锥栗中总黄酮的超声提取工艺条件，以乙醇体积分数、提取时间、液固比为试验因素，以锥栗总黄酮的提取率为考察指标，在单因素试验的基础上，采用星点设计-效应面法（CCD-RSM），对锥栗总黄酮的提取工艺条件进行了优化试验。结果表明，锥栗总黄酮的最佳提取工艺条件为：80%乙醇，超声提取20 min，固液比为24，提取温度为50 ℃。按此工艺提取，总黄酮的提取率为0.0685%；且此方法操作简便，结果稳定，预测性良好。

锥栗；星点设计-效应面法；总黄酮；超声提取

锥栗Castanea henryi为壳斗科栗属植物，又名珍珠栗，尖栗等[1]，主要分布于闽北及浙南山区等地。唐朝孙思邈的《千金要方》中云：“栗子，味咸温无毒，益气厚肠胃，补肾气，令人耐肌，生食之，甚治腰脚不遂。”《本草纲目》中记载：栗，肾之果也，栗能通肾，益气温胃，久食必强健。锥栗中所含的黄酮类化合物具有良好的抗氧化[2]、降脂、抗心律失常等功用[3]。为了优选锥栗中总黄酮的超声提取工艺条件，利用紫外-可见分光光度法，采用星点设计-效应面法，对锥栗中总黄酮的提取工艺条件进行了优化试验，CCDRSM可以克服均匀设计和正交设计试验结果不够精确、数学模型预测性较差的弱点，可以获得更高的提取率。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

供试锥栗为建瓯‘八月香’品种，经福建中医药大学药学院梁一池教授鉴定，其为壳斗科栗属锥栗的成熟种子。将锥栗去壳及种皮，种仁于40 ℃下干燥至恒重，粉碎，过40目筛，置于干燥器中以备用。

UV-9100紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；TDL80-2B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；THC-10B数控超声波提取器，济宁天华超声电子仪器有限公司；AR2130电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；芦丁对照品，成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%，批号为MUST-12040302。水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方 法

对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品4 mg，置于10 mL的量瓶中，加入70%乙醇溶解，并定容至刻度，摇匀，然后置于冰箱中冷藏以备用。

供试品溶液的制备：精密称取锥栗粉末约1 g，置于100 mL的锥形瓶中，量取60%乙醇10 mL，称定重量，浸泡30 min后，于50 ℃下超声提取30 min，放至室温后称重，补足失重，离心，取上清液，即得。

最大吸收波长的确定[4]：精密量取上述芦丁对照品溶液1 mL，置于10 mL的量瓶中，加入70%乙醇2.4 mL，加入5%的亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min后，加入10%的硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min后，再加入4%的氢氧化钠4 mL，加入70%的乙醇至刻度，摇匀，放置15 min后，以相应试剂为空白，于200～800 nm处扫描，结果发现，在510 nm处有最大吸收量，因而确定510 nm为测定的波长。

标准曲线的绘制[5]：分别移取2.1所述对照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于8个10 mL的量瓶中，加入70%的乙醇2.4 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min后加入10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min后加入4%氢氧化钠4 mL，加入70%乙醇至刻度，摇匀，15 min后于510 nm波长处比色测定，以相应试剂为空白，以对照品浓度X（mg·mL－1）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得到如下线性回归方程：

A＝11.659X＋0.0106（r＝0.9993，线性范围为0.008～0.064 mg·mL－1）。

星点设计试验：在单因素试验的基础上，采用星点设计试验[6]，以对总黄酮提取率影响较显著的乙醇体积分数（X1）、提取时间（X2）、固液比（X3）为自变量，以锥栗总黄酮提取率为因变量[7]。考虑到提取次数为非连续变量，结合生产实际，暂定为1次。试验因素与水平见表1。

表 1 锥栗中总黄酮超声提取工艺星点设计因素与水平Table 1 Factors and levels of the central composite design test of total flavonoids extraction in C. henryi nuts

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

精密度试验结果：连续6次测定同一对照品溶液，其吸光度的平均值为0.401，相对标准偏差RSD为0.417%，说明测定方法的精密度良好。

稳定性试验结果：取供试品溶液1份，显色15 min后，每隔5 min测定吸光度，在30 min的测定时间内，吸光度的平均值为0.391，相对标准偏差RSD为2.49%，表明供试品溶液在30 min内显色稳定。

重复性试验结果：取锥栗粉末6份，按照1.2中的“供试品溶液的制备”及“最大吸收波长的确定”方法进行处理，于510 nm处测定吸光度并计算总黄酮提取率，总黄酮平均提取率为0.046%，相对标准偏差RSD为2.74%，表明方法的重复性良好。

加样回收率试验结果：取已知含量的锥栗粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，分别置于锥形瓶中，各加入芦丁对照品溶液（0.243 mg·mL－1）1 mL，按1.2中的“供试品溶液的制备”及“最大吸收波长的确定”方法处理，于510 nm处测定吸光度，计算加样回收率，结果见表2，相对标准偏差RSD为1.98%，表明提取方法回收率良好。

2.2 试验数据的统计与分析

取锥栗粉末约1 g，精密称定，按表3中的试验号进行提取，按照上述测定方法测定锥栗中总黄酮的含量，结果见表3。

表 2 总黄酮加样回收试验结果Table 2 Result of total flavonoids recovery test

表 3 星点试验设计方案与试验结果Table 3 Scheme and result of the central composite design test

应用Design Expert 8.0.6软件对星点设计试验获得的数据进行多元回归与方差分析，对各试验因素进行多元线性回归和二项式拟合[8]。

多元线性回归方程为：

Y＝ 1.34×10－2＋ 5.68×10－4X1－ 3.549×10－5X2＋ 2.894 95×10－4X3，r＝ 0.849 0。

二项式拟合方程为：

Y=－ 3.79×10－4＋ 3.47×10－4X1＋ 5.56×10－4X2＋ 9.96×10－4X3－ 3.55×10－6X1X2－ 1.17×10－5X1X3－ 1.43×10－5X2X3＋ 4.72×10－6X12－1.67×10－6X22＋ 1.98×10－5X3

2，r=0.946 7。分析上述方程可知，多元线性回归方程的相关系数较低（r＝0.849 0），表明自变量和因变量之间的线性关系较差，拟合优度不佳，预测性不及二项式拟合的结果，因此该数学模型不合适，宜采用二项式拟合，结果见表4。

表 4 回归模型分析结果†Table 4 Analysis result of regression models

由表4中的P值可知，其中一次项X1为极显著，X3和交互项X2X3为显著水平，二次项和其他项均为不显著。模型为极显著水平，失拟项P＞0.05，表明模型因噪音干扰所致的机率较小，二项式拟合模型为成功拟合模型。

2.3 工艺参数的优化结果

根据拟合的二次多项式方程，绘制总黄酮提取率随各因素的影响而变化的效应面图，结果如图1～3所示。总黄酮提取率最大值为0.0685%，最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数为80%，提取时间为20 min，固液比为24。

图 1 乙醇体积分数和提取时间对总黄酮提取率的影响效应面图Fig. 1 Response surface curve to effect of ethanol volume fraction and extraction time on extraction rate of total fl avonoids

图 2 乙醇体积分数和固液比对总黄酮提取率的影响效应面图Fig. 2 Response surface curve to effect of ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on extraction rate of total fl avonoids

图 3 提取时间和固液比对总黄酮提取率的影响效应面图Fig. 3 Response surface curve to effect of extraction time and solid-liquid ratio on extraction rate of total fl avonoids

2.4 验证试验结果

根据最佳工艺条件提取并测定锥栗中总黄酮的含量，3组平行试验的平均提取率为0.0673%，相对标准偏差RSD为1.15%，实际值与预测值间的偏差率为－1.08%，这表明采用优化得到的工艺条件进行提取，可以获得较高的总黄酮提取率。

3 讨 论

凭借较好的试验精度和可分析的各个因素之间的相互作用，星点设计-效应面法在药学领域的运用越来越广泛，采用这种方法的试验次数比正交设计法有所减少，这样既节省了时间又节约了资源[9]。本试验因总黄酮提取率随乙醇体积分数的增加而持续增加，故效应面的曲面弧度较小，因而在实验中选取对因变量影响较显著的因素，效应面弧度将变大。

锥栗为药食两用的佳品，目前国内外对其生理生化、良种繁育[10]、生态、栽培[11]、病虫害、加工等方面的研究报道较多[12]，而对其保健方面的研究报道却较少。本试验对其总黄酮的提取工艺进行探讨，旨在为锥栗的进一步开发利用提供依据。

[1]杨利民.植物资源学[M].北京：中国农业出版社,2008：173.

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[3]李姣娟,戴 瑜.川桂叶总黄酮对油脂抗氧化作用的研究[J].中南林业科技大学学报,2011,31(10)：134－137.

[4]谢 臻,陈 勇,曾海生,等.星点设计-响应面法优选地桃花中总黄酮的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(12)：27－30.

[5]王婧杰,马凤鸣,穆立蔷.用响应面法优化超声波辅助提取紫椴枝皮中的黄酮[J].经济林研究,2012,30(4)：113－118.

[6]喻林华,方 晰.正交试验优选薄荷总黄酮超声提取工艺研究[J].中南林业科技大学学报,2012,32(8)：94－97.

[7]梁 雪,杨越冬.用加压溶剂萃取法提取板栗多糖的工艺条件[J].经济林研究,2013,31(3)：98－102.

[8]刘常青,谢友良,赖小平.星点设计-效应面法优选青天葵总黄酮提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(12)：24－27.

[9]刘艳杰,项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用[J].中国现代应用药学,2007,24(6)：455－457.

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[12]冯金玲,杨志坚,陈 辉.锥栗的研究进展[J].亚热带农业研究 ,2009,5(4)：237 － 241.

Optimization of total fl avonoids extraction process inCastanea henryinuts by central composite design and response surface method

ZHU Si, NIU Guang-jun, SU Su-jiao, LI Na, CHEN Shi-qiang, CHEN Liang, LIANG Yi-chi
(College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian, China)

To optimize extraction process of total flavoniods inCastanea henryinut, taking ethanol volume fraction,extraction time and liquid-solid ratio as factors, and extraction rate of total flavoniods as a selection index, based on results of single factor tests, extraction process of total fl avoniods inC. henryinut was optimized by central composite design and response surface method. The results showed that the optimum conditions were extracting for 20 min at 50 ℃with 80% ethanol, solid-liquid ratio was 24, and extraction rate of total fl avoniods was 0.0685%. The method was simple and stable, and had good predictability.

Castanea henryi; central composite design and response surface method; total flavonoids; supersonic extraction

S609.9；S792.17 文献标志码：A 文章编号：1003—8981(2015)01—0127—04

2014-03-09

福建省第四期林木种苗重点攻关项目“锥栗优良种质评选与应用研究”（闽林科〔2013〕1号）。

朱 思，硕士研究生。

梁一池，教授。E-mail：fafulyc@126.com

朱 思,牛广俊,苏素娇,等.用星点设计-效应面法优化锥栗总黄酮超声提取工艺[J].经济林研究,2015,33(1)：127－130.

[本文编校：伍敏涛]