D-果糖的酶法制备及其结晶条件的研究

李 闯，王 超，胡雪芹*，张洪斌(.合肥工业大学化学与化工学院，安徽合肥30009;.合肥工业大学医学工程学院，安徽合肥30009)

葡聚糖的生产是制备多糖类产品的技术核心，随着我国蔗糖农业产业的发展，其产值每年剧增，而右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrases)在其中扮演着重要角色。该酶能够水解断裂蔗糖分子内的α(1→2)糖苷键并将D-吡喃葡萄糖基催化转移到与酶分子C端的葡聚糖铆合域(Glucan binding domains)紧密结合的右旋糖酐大分子链上［1］，从而生成百万级分子量的右旋糖酐。在整个催化反应过程中果糖被释放出来，并大量游离于催化体系中。

果糖(Fructose)，分子式为C6H12O6，是一种最为常见的己酮糖，与葡萄糖是同分异构体，被认为是最甜最优的天然营养型甜味剂。果糖的代谢过程不依赖胰岛素［2］，其注射液可用于烧伤、创伤、术后及感染等胰岛素抵抗状态下或不适宜使用葡萄糖时需补充水分或能源的患者的补液治疗。此外，果糖还具有促进微量元素吸收、保护肝细胞、辅助治疗酒精中毒、预防龋齿和强化耐力等保健功能。其中，结晶果糖由于具有纯度高、性质稳定等特点而逐渐在食品、医药等行业得到开发与应用，其市场需求将不断扩大［3］。

然而，由于果糖独特的理化性质又使其晶体的制备技术面临着两大瓶颈。一是果糖在纯水中的溶解度极大(30℃下果糖的饱和溶液浓度为81.9%，m/m)，致使饱和溶液的黏度也很大，较大的黏度会降低母液的流动性，阻碍结晶过程中的传质。研究发现，向结晶体系内加入乙醇等能够与水互溶的有机试剂可以降低果糖的溶解度与其母液的黏度［4－5］。Flood等［6］分别对果糖在不同的水－乙醇比例和不同温度下的折射指数、黏度、密度和溶解度等进行了较为深入的研究，结果发现在水∶乙醇为1∶4(m/m)的体系下果糖的溶解度大幅度减少且结晶母液的黏度大幅下降，故将此作为果糖结晶体系，进行较为细致的工艺参数研究。除加入乙醇，也有通过加入表面活性剂来改善糖浆的黏度［7］。二是果糖的理化性质较为活泼，晶体放置在空气中极易吸水潮解，在加热过程中容易氧化分解生成棕黄色的5-羟甲基糠醛［8］，而后者作为杂质在我国药典中受到严格控制［9］。

笔者以前期工作摸索出的最佳酶催化及纯化条件为基础，研究了果糖在水－乙醇体系中的结晶条件，并进行了相关工艺参数的优化，最后，对结晶产品进行了高效液相色谱、中红外光谱及元素检测分析，以期解决果糖结晶中所遇到的上述两大问题，为实现葡聚糖生产过程中副产物果糖的回收利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖(国药集团化学试剂有限公司，BR)，色谱级乙腈(TEDIA公司)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，AR)。

右旋糖酐蔗糖酶粗酶液(80 U/ml)来自重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28-dexYG(合肥工业大学医学工程学院药物设计实验室构建并保藏)，酶的制备方法参见文献［10］。

1.2 试验方法

1.2.1 果糖的酶法制备。

1.2.1.1 右旋糖酐蔗糖酶的酶催化反应。用乙酸－乙酸钙缓冲液配制浓度为125 g/L的蔗糖底物溶液作为酶的催化反应体系，并按2 U/ml的用量比例加入右旋糖酐蔗糖酶酶液，控制温度在25～30℃，150 r/min反应30 h。

1.2.1.2 果糖的分离与纯化。酶的催化体系在70℃下水浴加热20 min以终止反应，加入乙醇沉淀、过滤去除右旋糖酐，之后浓缩上清液去除乙醇及部分水，浓缩得到的糖浆再经钙型阳离子交换树脂色谱分离精制后得到纯度较高的果糖溶液。

1.2.2 果糖结晶条件的研究。

1.2.2.1 晶种的制备。将结晶果糖在研钵中研磨过筛，取100～150目的粉末作为晶种，其粒径在100～165 μm，密封保存以备用。

1.2.2.2 结晶方法。将果糖溶液浓缩至一定浓度后，按照水∶乙醇=1∶4的质量比加入无水乙醇提高结晶母液的流动性和过饱和度，之后加入果糖晶种，控制整个结晶体系以0.5～1.0℃/h的降温速率从50℃至10℃冷却结晶，期间保持150 r/min的搅拌转速。最后经过滤、乙醇清洗、60～70℃真空干燥至恒重，计算结晶收率。

结晶收率的计算公式:

1.2.2.3 结晶母液的纯度对结晶的影响。按照酶催化反应液中所含有的组分及含量，将蔗糖、葡萄糖和麦芽糖按照2∶1∶4的比例充分混合，分别配制成果糖纯度为75%、80%、85%、90%、95%(m/m)的混合糖溶液，并按照基本试验方法进行结晶。

1.2.2.4 母液白利度对结晶收率的影响。将精制后纯度在90%以上的果糖溶液浓缩至70、75、80、85 和90 Brix°，进行批次冷却结晶，依次测定结晶收率，重复3次并取平均值作图。

1.2.2.5 晶种的添加量对结晶收率的影响。将精制后纯度在90%以上的果糖溶液浓缩至85 Brix°，分别添加总固形物质量0、5%、10%、15%和20%的果糖晶种进行批次冷却结晶，依次测定结晶收率，重复3次并取平均值作图。

1.2.2.6 养晶时间对结晶收率的影响。将精制后纯度在90%以上果糖溶液浓缩至85 Brix°，并添加总固形物质量10%的果糖晶种，经冷却结晶过程之后保持15℃和150 r/min的转速分别养晶0、3、6、9和12 h后，依次测定结晶收率，重复3次并取平均值作图。

1.2.3 分析检测方法。

1.2.3.1 纯度的检测。果糖溶液纯度的测定采用高效液相色谱层析(HPLC)外标法［11］，德国 Waters示差检测器，色谱条件为:Rezex RCM-Monosaccharide Ca+2(300 mm ×7.80 mm)，柱温为85 ℃，流动相为去离子水，流速1.0 ml/min，进样量为20 μl。以被检物质的浓度Y(mg/ml)对峰面积的lg值x作图，得到标准曲线，回归方程分别为:Y=0.214+2.774x;R=0.988 4，线性范围在20 ～120 mg/ml。

1.2.3.2 结晶产物中5－羟甲基糠醛的检测。取0.5 g结晶产物，加水10 ml充分溶解后，经紫外－可见分光光度法检测，在284 nm 波长处测定，吸光度不能超过 0.32［9］。

1.2.3.3 其他检测方法。溶液中总固形物含量的测定采用阿贝折光仪，即折光法，单位为Brix°，又称白利度。

傅立叶中红外光谱分析采用溴化钾压片，检测波数在4 000 ～400 cm－1。

元素分析测定条件为炉温1 150℃，还原管850℃，对结晶果糖进行元素含量测定。

2 结果与分析

2.1 结晶母液的纯度对结晶的影响 结晶虽然是一种有效的分离手段，但杂质，甚至是微量的杂质会给结晶过程带来很大影响［12］，如果结晶母液中目的产物的纯度达不到结晶要求，最终可能只得到产物与杂质的无定型油状沉积物［13］。Chu等［14］分别以葡萄糖和聚果二糖作为果糖结晶过程中的杂质进行了研究，结果表明，杂质的存在在一定程度上影响晶体的生长速率。在相同纯度条件下含有聚果二糖结晶体系的平均生长速率比含有葡萄糖的结晶体系低。因此，母液的纯度对物质的结晶起着至关重要的作用。

表1 母液的纯度对结晶的影响

在其他杂糖的干扰下果糖晶体的生长速率明显减小，宏观体现在最终的结晶收率上。此外，杂糖含量过多还会对结晶体系的稳定性造成破坏，在果糖纯度只有75%时，结晶母液在加入乙醇改性之后体系会迅速转变为乳白色［15］，为保证较高的结晶率以及较好的晶体质量，要求纯度在90%以上的果糖才可以进行结晶(表1)。

2.2 母液白利度对结晶收率的影响 母液白利度对结晶收率的影响见图1。由图1可知，起始结晶时母液的白利度在75 Brix°以下时没有结晶果糖生长或产率极低，说明此浓度下糖浆溶液在降温过程中始终没有达到结晶所要求的过饱和度。此外，结晶产率在母液的白利度达到80 Brix°以上时显著提高，(在 85 Brix°时最大，为 52.36%)，在 90 Brix°时虽然有所增加但浓缩时间越长，果糖越容易氧化变色，且产率增加不大，综合考虑认为起始结晶时母液的白利度在85 Brix°左右最为合适。在此条件下，可以计算出50℃、水－乙醇比例为 1∶4的结晶体系下的初始过饱和度为 1.21［6，16］。

2.3 晶种的添加量对结晶收率的影响 晶种的添加量对结晶收率的影响见图2。由图2可知，当晶种添加量在总固形物质量10%时收率最高，达到56.73%。在不添加晶种时虽然也有结晶析出，但由于没有外加晶种的诱导作用只靠自发成核生长;当晶种添加过多时会由于晶体粒径不均匀所产生的奥斯特瓦尔德熟化(Ostwald Ripening)、生长速率分散(Growth Rate Dispersions)等现象的发生，使得收率降低和结晶质量下降［17－18］。

2.4 养晶时间对结晶收率的影响 养晶时间对结晶收率的影响见图3。由图3可知，养晶时间对于结晶收率的影响作用较小，在养晶时间达到9 h时收率达到最大60.51%，且一直维持在60%左右。

2.5 酶法制备结晶果糖的检测与分析

2.5.1 高效液相色谱(HPLC)检测。将精制后的催化反应液与结晶产物溶液分别进行HPLC检测，结果见图4。由图4可知，果糖在钙离子色谱柱的出峰时间为14 min左右，表明纯化精制后的果糖经结晶操作后其纯度有很大提高。

2.5.2 傅立叶中红外光谱检测分析。由图5可知，制备的结晶果糖与标品均在3 400、2 890、2 830、1 640、1 410、1 080、868和818 cm－1处有较强的吸收峰，其中，3 400 cm－1附近为糖分子中 －OH的伸缩振动峰，2 890与2 830 cm－1为 C-H伸缩振动峰，1 640 cm－1为糖类－OH的吸收峰，1 410 cm－1为C-H的弯曲振动峰，1 080 cm－1为糖环的特征吸收峰，868与818 cm－1为吡喃环的特有吸收峰［19－20］，证明了结晶形态下的果糖是一种吡喃环结构［21］。

2.5.3 元素分析。由表2可知，该结果符合果糖(C6H12O6)中各个元素所占比例的理论值，所以通过该方法得到的结晶果糖中不含游离水及结晶水。

表2 元素分析 %

3 结论与讨论

该研究较为详细地探索了果糖在水－乙醇为1∶4体系下的结晶条件，并对部分工艺参数进行了优化。首先，母液的纯度是果糖结晶的必要前提，杂质含量大于10%的体系在加入乙醇改性后，体系的稳定性降低，最终仅得到油状沉淀物。其次，与过饱和度密切相关的浓度参数同样对结晶产生重大影响。研究发现，结晶收率在母液的白利度达到80 Brix°以上时显著提高，此条件下的过饱和度在1.20左右。此外，晶种的量与养晶时间均对结晶收率具有一定的影响。

试验中果糖作为右旋糖酐蔗糖酶的副产物得到有效的回收，且相对于国内一些利用该酶制备结晶果糖的工艺，其流程得到较大简化，加之结晶过程能耗低，符合当今绿色工业农业经济的要求，为结晶果糖的制备开辟了一条崭新的道路。

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