生防菌BS04防治辣椒疫病机制

李建文　高易宏　吴辉　江翱　孙文秀

摘要：从生防菌的根际定殖、防效和诱导防御酶活性3个方面探讨了生防菌BS04防治辣椒疫病的机制。结果表明，生防菌BS04能够在辣椒根际定殖，且定殖密度比较稳定，稳定维持在105 CFU/g以上；盆栽试验测定防治效果表明，生防菌BS04的培养液对辣椒幼苗期疫病有较明显的防治效果，防效达85.81%；防御酶活性测定结果显示，接种辣椒疫霉菌后，辣椒叶片的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的活性均显著提高并出现峰值，但生防菌BS04培养液和辣椒疫霉菌共同处理后，各种防御酶的活性有所降低，并表现出相对平缓的状态。

关键词：生防菌；辣椒疫病；防病机制；生物防治；防御酶

中图分类号： S436.418.1+9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0151-03

辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起，是辣椒生长过程中发生比较严重的土传病害[1-3]。多年来，国内外学者使用化学药剂[4]、选育抗病品种[5]、生物防治[6]等措施不断加强对辣椒疫病的防治。但由于辣椒疫霉菌变异能力强，致病力分化明显，容易产生抗药性，采用化学药剂和选育抗病品种防治辣椒疫病存在极大的弊端。利用有益微生物防治辣椒疫病成为首选的有效措施，越来越多的生防菌也受到了人们的关注。目前，已从土壤及植物等不同来源分离筛选到若干株对辣椒疫霉菌具有拮抗作用的生防菌[7-14]，但对其防病机制的研究还不够深入。笔者从辣椒根际土壤中分离筛选到对辣椒疫霉菌具有较强的抑制作用，且对其他几种病原菌具有拮抗作用的生防菌BS04（待发表）。为进一步明确生防菌BS04对辣椒疫病的防治效果，本试验对该菌株在辣椒根际的定殖、对辣椒疫病的防效及对辣椒叶片防御酶系的活性影响进行了研究，为更深入探讨其防病机制提供资料和奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和培养基

供试菌株BS04为笔者所在实验室从辣椒根际土壤中分离获得的对辣椒疫霉菌等多种植物病原菌具有较强拮抗作用的生防细菌。经形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析，鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。辣椒疫霉菌为笔者所在实验室保存。

牛肉膏蛋白胨培养基（NA）用于培养菌株BS04，马铃薯葡萄糖培养基（PDA）用于培养辣椒疫霉菌，胡萝卜培养基（CA）用于辣椒疫霉菌产孢。

1.2 抗卡那霉素突变株的筛选

将BS04菌株接种到NA培养基平板上，待长出菌落后用紫外线照射30 s，再将其转接到卡那霉素浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/mL的NA平板上，直到筛选出抗2.0 μg/mL卡那霉素并对病原菌的拮抗作用保持不变的BS04突变株。

1.3 BS04菌株在辣椒根际的定殖

将卡那霉素抗性BS04突变株接种至卡那霉素2.0 μg/mL的NA液体培养基中，28 ℃，200 r/min振荡培养24 h，配制成浓度为2×108 CFU/mL的菌悬液。将生长至6叶期的辣椒幼苗在上述菌悬液中浸根1 h后移栽至盆钵中，温室中管理，每隔7 d取样检测BS04菌株在辣椒根际的定殖情况。测定方法如下：轻轻拔出辣椒幼苗，清水冲洗根部，并用吸水纸吸去根表水，剪下根系，称质量，研磨，无菌水稀释，涂在含有卡那霉素的NA培养基平板上，28 ℃培养48 h后计算菌落的数量。

1.4 BS04菌株对辣椒疫病的防效

选取6叶期的健康辣椒幼苗60株，每盆（直径10 cm）1株，平均分为2组。一组将浓度为2×108 CFU/mL的BS04菌悬液20 mL浇灌到栽有辣椒幼苗的盆钵中，7 d后采用灌根法接种辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液（5×103个/mL）10 mL；另一组以无菌水处理为对照，7 d后用辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液（5×103个/mL）10 mL灌根。10 d后调查病情指数，参照 Hartman 的方法进行辣椒疫病病情分级，并计算防治效果。

1.5 BS04菌株处理后辣椒叶片SOD、POD、PPO和PAL酶活性测定

选取室内盆栽的6叶期健康辣椒苗，设如下4个处理：①喷雾接种BS04菌株培养液（含菌量约为108 CFU/mL）；②喷雾BS04菌株培养液（浓度同①）和辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液（103个/mL）；③喷雾接种辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液（103个/mL）；④清水。每个处理重复3次。分别于处理后1、2、3、4、5、6、7 d取样，制得过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的粗酶液，-20 ℃保存备用。SOD活性测定采用NBT光还原法[15]；POD活性测定采用愈创木酚法[15]；PPO活性测定采用邻苯二酚法[15]；PAL活性测定采用分光光度法[16]。

2 结果与分析

2.1 BS04菌株在辣椒根际的定殖

采用菌液浸根的方法对生防菌BS04在辣椒根际的定殖情况进行分析，结果（表1）表明，BS04菌株能够在辣椒根际定殖，且定殖密度比较稳定，处理后7 d时定殖密度是5.89×105 CFU/g，处理后35 d时定殖密度是5.12×105 CFU/g，均稳定维持在105 CFU/g以上。

2.2 BS04菌株对辣椒疫病的防治效果

盆栽试验结果（表2）表明，生防菌BS04的培养液对辣椒幼苗期疫病有较明显的防治效果。辣椒幼苗在接种病原菌后7 d开始发病，根茎部出现变黑症状，10 d后调查病情指数及防效，发现无菌水处理的辣椒幼苗全部发病，甚至死亡；而生防菌BS04处理后的辣椒幼苗仍有大量存活，表现轻微发病，防效达到85.81%。

2.3 BS04菌株处理后辣椒叶片SOD、POD、PAL和PPO酶活性的变化endprint

采用不同方式处理辣椒幼苗后，其叶片各防御酶活性的测定结果见图1。由图1可见，用BS04培养液和清水处理后，辣椒叶片各防御酶活性的变化相对比较平稳；而单独接种病原菌和接BS04培养液后再接种病原菌的2个处理，除SOD酶活性变化较平缓外，其他3种防御酶活性出现较大变化。此外，SOD、POD和PAL 3种酶活性变化的趋势基本相同，而PPO酶活性的变化则与其不同。与采用BS04培养液和清水处理相比较，单独接种病原菌和BS04+病原菌的处理表现出较高的防御酶活性。研究发现，单独接种病原菌后辣椒叶片的防御酶活性比BS04+病原菌处理后的活性要高一些，这可能与只接种病原菌能够诱导酶活性的提高，而生防菌BS04可以抑制病原菌的生长导致酶活性降低有一定的关系。同时发现，SOD、POD和PAL 3种防御酶在接种病原菌和BS04+病原菌处理后3 d时酶活性达到峰值，而PPO酶活性则与之不同，在处理后 5 d 时达到最高点，然后随时间推移不断降低。

3 讨论

植物病害生物防治是指利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治的技术和方法。其防病机制主要包括分泌抗菌物质、竞争生态位和营养物质、诱导系统抗性及促进植株生长增强植株抗逆性4个方面。研究表明，菌株能否在宿主植物体内或根际土壤中定殖，对生防菌的防病效果具有重要影响[17]。更多学者认为诱导植物获得系统抗性在生防菌的防病过程中起主要作用[18]，并进行了大量研究。枯草芽孢杆菌作为目前研究较多、应用较为广泛的生防菌，对其防病机制的研究报道较多，但对土传病害辣椒疫病的防病机制系统研究较少。

本试验结果表明，生防菌BS04对辣椒疫霉菌具有较强拮抗作用，能够明显抑制菌丝生长，并在辣椒根际稳定定殖，对辣椒疫病也有较高的防治效果。本试验中采用单独接种辣椒疫霉菌和BS04+辣椒疫霉菌处理后，均较好地诱导了辣椒

幼苗叶片内SOD、POD、PAL和PPO防御酶的活性，这与前人的研究结果[19-20]基本一致。SOD和POD是细胞内清除活性氧的保护酶，同时POD可催化酚类物质的前体聚合成木质素，增强寄主的抵抗性。PAL是酚类物质、植保素和木质素合成的关键酶，病原菌侵染后会激发寄主植物的PAL活性提高。PPO可以将酚类物质氧化形成醌类物质，对外来的病原菌产生抑制作用。试验结果表明，上述防御酶活性的增强，提示了辣椒抗病性的提高，但也发现生防菌BS04和辣椒疫霉菌混合接种后辣椒叶片防御酶活性比仅接种病原菌要低一些，这可能与BS04菌株和病原菌相互作用有一定的关系，具体原因还有待于进一步研究。

参考文献：

[1]周启明，李林英，杨淑华. 辣椒疫病的调查研究[J]. 中国蔬菜，1984（1）：40-43.

[2]Hwang B K，Kim C H. Phytophthora blight of pepper and its control in Korea[J]. Plant Dis，1995，79：221-227.

[3]Hausbeck M K，Lamour K H. Phytophthora capsici on vegetable crops：research progress and management challenges[J]. Plant Disease，2004，88（12）：1292-1303.

[4]李 帅，王满意，王红学，等. N-（3，5-二甲氧基-4-烷氧基苯乙基）扁桃酰胺类杀菌剂的设计合成及杀菌活性[J]. 农药学学报，2012，14（1）：17-23.

[5]曾 莉，曹必好，徐小万，等. 辣椒抗疫病遗传与育种的最新研究进展[J]. 中国农学通报，2010，26（12）：174-177.

[6]杨琦瑶，索雅丽，郭荣君，等. 枯草芽孢杆菌B006对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌组分分析[J]. 中国生物防治学报，2012，28（2）：235-242.

[7]尹敬芳，张文华，李健强，等. 辣椒疫病生防菌的筛选及其抑菌机制初探[J]. 植物病理学报，2007，37（1）：88-94.

[8]马晓飞，刘长远，赵奎华，等. 辣椒疫病生防菌株鉴定及控病机理研究[J]. 中国农学通报，2012，28（10）：136-141.

[9]何延静，刘海明，胡洪波，等. 一株拮抗辣椒疫霉的假单胞菌的分离与鉴定[J]. 微生物学报，2006，46（4）：516-521.

[10]梅新兰，赵青云，谭石勇，等. 辣椒疫病拮抗菌株筛选、鉴定及其防效[J]. 应用生态学报，2010，21（10）：2652-2658.

[11]袁树忠，周明国. 辣椒疫病生物防治菌株的筛选与定殖[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2006，27（4）：93-97.

[12]杨瑞先，陶玉凤，宋美仙，等. 银杏内生细菌防治辣椒疫病研究[J]. 中国生物防治学报，2012，28（4）：552-559.

[13]Lim J H，Kim S D. Biocontrol of phytophthora blight of red pepper caused by Phytophthora capsici using Bacillus subtilis AH18 and B. licheniformis K11 formulations[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry，2010，53（6）：766-773.

[14]Lee K J，Kamala-Kannan S，Sub H S，et al. Biological control of Phytophthora blight in red pepper （Capsicum annuum L.） using Bacillus subtilis[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24（7）：1139-1145.

[15]高俊凤. 植物生理学技术（四） [M]. 西安：世界图书出版社西安公司，2000.

[16]薛应龙. 植物生理学实验手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1985：138-139.

[17]郭坚华，龚龙英，祁红英，等. 三个拮抗菌株对辣椒青枯病的作用机制[J]. 中国生物防治，2003，19（1）：6-10.

[18]van Peer R，Niem ann G J，Schippers B. Induced resistance and phytoalex in accum ulation in biological control of Fusarium wilt of carnaion by Pseudomonas sp.strain WCS417[J]. Phytopathology，1991，81：728-734.

[19]柳 凤，欧雄常，何 红，等. 红树内生细菌RS261防治辣椒疫病机理的初步研究[J]. 植物病理学报，2010，40（1）：74-80.

[20]邱思鑫，何 红，阮宏椿，等. 内生芽孢杆菌TB2防治辣椒疫病效果及其机理初探[J]. 植物病理学报，2004，34（2）：173-179.杨 洋，胡永红，杨文革，等. 多抗菌素发酵培养基响应面优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：154-158.endprint