基于生物质甘蔗渣的荧光碳量子点制备

陈文新，阳运华，刘应亮，曹喜民

（1．暨南大学生命科学技术学院化学系，广东广州510632；2．广东省微生物研究所，广东广州510070；3．华南农业大学理学院，广东广州510642；4．广东省清远市美乐仕油墨有限公司，广东清远511500）

基于生物质甘蔗渣的荧光碳量子点制备

陈文新1，阳运华2，刘应亮3，曹喜民4

（1．暨南大学生命科学技术学院化学系，广东广州510632；2．广东省微生物研究所，广东广州510070；3．华南农业大学理学院，广东广州510642；4．广东省清远市美乐仕油墨有限公司，广东清远511500）

本实验以富含纤维素的废弃生物质甘蔗渣为原料，采用水热法合成了具有荧光性能的碳量子点．对碳量子点进行了表征，其粒径大小约为5～10 nm；在紫外灯照射下发蓝色荧光，对其荧光性能进行了研究，发现其具有多元激发、多元发射的性质．对其细胞毒性进行了研究，结果表明是一种生物相容性良好的标记材料．

荧光碳量子点；甘蔗渣；水热碳化；细胞标记

近年来，荧光碳纳米材料因其具有良好的光学特性和细胞低毒性引起了科研工作者们的广泛研究．它具有较好的光稳定性，且无毒副离子的存在，适用于长时间的检测和示踪的实验，在生物标记［1］和分析检测［2］等方面具有广阔的应用前景．如Sun等［3］采用PPEI－EI钝化后的碳量子点用于人体乳腺癌MCF－7细胞的标记；Li等［4］利用碳量子点实现了对DNA的检测；Goncalves等［5］将碳量子点用作生物纳米传感器，用于检测环境中重金属汞离子的存在，这种探针具有可逆性、反应时间短和稳定的优点，丰富了碳量子点的应用范围．

目前人们已通过不同的原料成功地制备出了荧光碳纳米材料［6］，主要是各种有机小分子物质如采用葡萄糖［7］、蔗糖［8］、果糖、柠檬酸［9］等；也有采用石墨［10］、多壁碳纳米管［11］、蜡烛灰［12］等为原料制备碳量子点．随着人们对环境的重视，废弃生物质的利用越来越引起大家的关注，已有不少研究者采用以废弃生物质为原料制备荧光碳纳米材料．如：Sarkar等［13］通过收集烘烤花生所产生的花生衣在氮气700℃下制备了荧光碳质纳米球．Chang等［14］将蓝山咖啡渣为原料获得了含sp2碳的量子点，Han等［15］将西瓜皮在220℃碳化2h，获得了2nm左右的碳纳米粒子．Krysmann等［16］以生物质草为原料，通过热解的方法获得了具有荧光性能的碳量子点．Sun等［17］过水热处理柚子皮来制备荧光碳纳米粒子，而我们课题组也以生物质壳聚糖为原料，制备了氨基功能化的荧光碳纳米粒子［18］．

甘蔗渣是指甘蔗经过榨糖之后剩下的部分，它来源集中、产量大，是一种重要的可再生生物资源．它的成分以纤维素，半纤维素以及木质素为主，木质化程度高，蛋白、淀粉和可溶性糖含量较少．以甘蔗渣作为制备碳材料的来源也有报道，如Nieto－Delgado［19］和Purnomo等［20］采用甘蔗渣作为原料制备活性炭，Zhuo等［21］以甘蔗渣制备活性炭并将其应用于超级电容器．

在本研究中，选用富含纤维素的废弃生物质甘蔗渣作为碳源，采用绿色环保的水热碳化技术，制备具有荧光性能的碳量子点，为废弃生物质材料的利用开辟了一个新的途径．

1 实验部分

1．1 试剂与仪器

甘蔗进行压榨，多次水洗过滤除去剩余糖分，并烘干备用；实验所用水为超纯水．

1．2 荧光碳量子点的合成和表征

将1．0 g甘蔗渣粉末（已干燥碾碎）分散于30 mL蒸馏水中，然后倒入50 mL的聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜里，密封后将反应釜置于180℃下恒温反应12 h，然后自然冷却至室温，打开反应釜，将所得的产物超声分散，然后离心分离，除去沉淀，对所获得的上层液进行透析，最后将产品冷冻干燥24 h，获得产物在紫外灯照射下发蓝色荧光的碳量子点（carbon dots，CDs）．

采用JEOL JEM－2010HR型高分辨透射电子显微镜对样品形貌进行表征；原子力显微镜（AFM）在SPM Dimesion 3100型原子力显微（Veeco，美国）镜上采用Tapping模式进行；傅立叶红外光谱（FTIR）用德国Bruker EQUINOX 55型傅立叶红外吸收光谱仪上测定；紫外吸收光谱采用Cary 5000（Varian）光谱仪进行测定；采用荧光光谱仪（F－4500，150 W Xe灯，日立公司）对其荧光性能进行测试．

1．3 细胞标记

所使用的细胞为人肺腺癌细胞株A549细胞，暨南大学医学院提供．DMEM培养基及胎牛血清等，Gibcobrl公司，美国．实验中需要用的EP管、一次性枪头及一次性塑料离心管都采用高压灭菌，培养皿采用紫外线照射杀菌．

将培养好的人体肺腺癌上皮细胞A549接种到激光共聚焦专用培养皿中，在含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液中，于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，铺满培养皿后为其更换新的培养基，再加入质量浓度为100 μg／mL的荧光碳量子点共孵育6 h．倒掉培养基，将细胞用PBS冲洗3次，加入戊二醛固定液使细胞固定15 min．于激光共聚焦显微镜下观察细胞的成像情况，选择激发波长为405 nm并进行荧光拍照．

1．4 体外细胞毒性试验

采用MTT法检测细胞毒性，MTT溶液采取现用现配，避光操作，称取20 mg MTT固体粉末，加入4 mL的PBS（磷酸盐缓冲液pH 7．4）溶液，充分混匀后避光使用．

将人体肺腺癌上皮细胞A549培养在加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在体积分数为5%的CO2细胞培养箱中37℃恒温培养．取对数生长期的A549细胞，细胞量为5×104／孔，接种到96孔细胞培养板，每孔各加入100 μL DMEM培养基，培养24 h后，加入不同质量浓度的荧光碳量子点（25、50、100、200 μg·mL－1），对照组细胞为不加任何材料的DMEM培养基，每个质量浓度组加9个孔．96孔板置于37℃培养箱下分别培养24、48、72 h，洗细胞3次后进行毒性试验．每孔加入20 μL质量浓度为5 mg／mL的MTT溶液，继续反应4 h，弃去含材料的培养液，PBS洗涤1次，于各孔中加入助溶剂酸化异丙醇，混匀至活细胞与MTT形成的紫色结晶完全溶解后，置于酶标仪上，490 nm下读取A值，比较毒性影响．

以A490作为细胞增殖的指标，数值为3次实验的平均值，每次实验每个样本在每个质量浓度和每个实验时间点都设置9个复孔．细胞相对活性计算公式如下：

细胞相对活性（%）＝（A490样本－A490空白）／（A490对照－A490空白）×100

其中A490样本为所测样本的吸收值，A490对照为没经处理的仅有活细胞的对照孔的对照值，A490空白为空白孔的吸收值；Control组采用的对照是0 h的，认为其是100%的细胞存活率，使用SPSS统计软件对数据进行处理，数据以均值标准差表示．

2 结果与讨论

2．1 透射电镜分析

从普通透射电镜（图1a）中可以得出，所制备的碳量子点有一个较为广泛的粒径分布，由几个纳米至十几个纳米不等．从高分辨透射电镜（图1b）可以看出，以甘蔗渣为原料制备的碳量子点粒径大小均匀，大约为5～10 nm，且具有晶格条纹，其晶间距为0．32 nm．

（a）碳量子点的透射电镜图；（b）高分辨透射电镜图图1 碳量子点的透射电镜图（a）TEM image of the CQDs；（b）HRTEM image of the CQDsFig．1 TEM image of CQDs

2．2 原子力显微镜分析

图2是所制备的碳量子点的原子力显微镜图片，从图中可以得出其粒径约为2～20 nm，具有较宽的粒径分布．

（a）碳量子点于云母片上的原子力显微镜图；（b）图a中划线部分的高度图；（c）碳量子点的三维图谱图2 碳量子点的原子力显微镜分析（a）AFM image of the CQDs deposited on freshly cleaved mica substrates；（b）The height profile along the line in（a）；（c）The 3－d image of the CQDs．Fig．2 AFM image of CQDs

2．3 红外光谱分析

从碳量子点的红外光谱图（图3）可以看出，3 433 cm－1吸收峰对应O－H氢键的伸缩振动，1 700 cm－1和1 623 cm－1吸收峰分别属于和伸缩振动峰；在1 000～1 500 cm－1内的吸收峰对应C—O键的伸缩振动和O—H键弯曲振动吸收，表明样品表面有一定的羟基、羧基等官能团．

图3 碳量子点的红外光谱图Fig．3 FTIR spectra of the CQDs

2．4 紫外和荧光光谱分析

图4a给出了甘蔗渣水热碳化样品的紫外吸收光谱图，从图中可以看出，碳量子点在紫外吸收区域没有一个很明显的吸收峰，但是有一个宽的吸收波谱，这很可能是由于量子点的一个比较宽的粒径分布．制得的碳量子点在水溶液中具有较好的分散性，能保持半年以上无沉淀产生．同时，在365 nm的紫外灯照射下，溶解于水的量子点溶液发出强的蓝光（如图4a中插图所示）．为进一步研究所得到的碳量子点的光学性质，图4b是采用F4500荧光分光光度计在不同的激发波长激发碳量子点后得到一系列光致发光光谱．从图中可以看出，碳量子点与其他大部分发光碳纳米粒子的荧光光谱图一样，都依赖于激发波长，呈现出多元激发、多元发射的荧光光谱特性．当激发波长向长波方向移动时，荧光发射峰也随之红移．当激发波长从300～480 nm变化时，其最大发射峰位置和强度也随之变化，发光强度是先增加后降低；其中360 nm左右达到最佳激发波长．从以360 nm的波长作为激发波长获得的荧光发射谱图可以看出，最强的发射峰出现在450 nm左右，整个发射峰覆盖在420～550 nm之间，属于蓝光范围，这与波长为365 nm的紫外灯照射下观察到的蓝光发射是一致的．

（a）碳量子点的紫外图谱（插图为碳量子点溶液于365 nm紫外灯照射下图片）；（b）碳量子点在不同激发波长（300～480 nm）下的发射光谱图4 碳量子点的吸收光谱和发射光谱（a）Absorption spectra of the CQDs（inset：photograph of the samples excited by a 365 UV lamp）；（b）Emission spectra of the CQDs at different excited（300～480 nm）Fig．4 Absorption spectra and emission spectra of the CQDs

同时，对所获得的碳量子点进行了荧光量子产率的测定，测得其荧光量子效率约为1．65%．

我们认为荧光碳量子点的形成是由于甘蔗渣中的主要成分如纤维素、木质素、可能的剩余糖分等碳水化合物在水热条件下进行碳化，形成了具有荧光性能的碳量子点．

2．5 细胞标记与体外细胞毒性

将碳量子点用220 nm的过滤膜过滤，然后取10 μL加入到含有90 μL的1%BSA的PBS－Mg（PBS＋5 mM MgCl2）EP中，用移液枪吹打混合均匀．先采用PBS溶液对细胞进行冲洗3次，洗掉培养液，然后加入配好的碳量子点与PBS缓冲液的混合物，于37℃培养箱中继续孵育4 h，然后用PBS缓冲液清洗3遍以上，洗掉未标记上的荧光碳量子点溶液，采用戊二醇固定，于激光共聚焦显微镜下进行观察．

（a）543 nm激发，633 nm发射；（b）无荧光；（c）图（a）和（b）的叠加图5 碳量子点标记A549细胞的激光共聚焦显微镜图（a）ex：543 nm，em：633 nm；（b）A brightfield；（c）An overlay image of（a）and（b）．Fig．5 A confocal fluorescence microphotograph of A549 cells labeled with the carbon quantum dots

激光共聚焦的设置参数为：采用543 nm激发、633 nm发射波长下观测其红色荧光，采集图片，所获得的细胞标记图片如图5所示．从图中可以看出，碳量子点能很好地进行细胞标记，且在543 nm的波长激发下，能发红色荧光．

图6 碳量子点在不同质量浓度以及不同培养时间的细胞毒性Fig．6 Cytotoxicity evaluations test of A549 cells with different concentrations of carbon quantum dots after 48 h and 72 h incubation

同时，对碳量子点的细胞毒性也进行了测试，结果表明（图6），与细胞培育72 h时未发现碳量子点对细胞产生明显的毒性，当质量浓度为200 μg／mL，孵育时间为72 h时，细胞的活性仍超过了85%，结果表明我们所合成的碳量子点与其他碳量子点一样，具有较低的细胞毒性，在生物标记中具有较好的应用前景．

3 结论

采用生物质废弃物甘蔗渣作为碳源，利用水热法制得了良好分散性的碳量子点，对其荧光性能进行了分析，发现具有一定的荧光性能，发射波长依赖于激发波长，呈现出多元激发、多元发射的荧光光谱特性，测得其荧光量子效率为1．65%．采用A549细胞进行荧光标记，结果显示所制得的碳量子点具有良好的荧光标记性能，在200 μg／mL的质量浓度下培养72 h后细胞的成活率仍然在85%以上，生物相容性较好．这种制备方法为我们进一步采用其他生物质原料为碳源，制备具有荧光性能的碳纳米材料提供了实验方法．

特别鸣谢：感谢清远市美乐仕油墨有限公司资助项目对本论文的帮助．

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［责任编辑：刘蔚绥］

Facile synthesis of fluorescent carbon nanodots derived from biomass bagasse by hydrothermal treatment

CHEN Wenxin1，YANG Yunhua2，LIU Yingliang3，CAO Ximin4
（1．Department of Chemistry，School of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China；2．Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070，China；3．College of Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；4．Mei Le Shi Printing Ink Company Limited，Qingyuan 511500，China）

We developed a hydrothermal carbonization route to prepare carbon quantum dots（CQDs）by using sugarcane bagasse-an agricultural waste as carbon precursor．The obtained CQDs had a size distribution of 5～10 nm．The fluorescence property of the CQDs was the same as the other carbon dots，having multiple excitation and multiple emission．

fluorescent carbon dots；sugarcane bagasse；hydrothermal carbonization；cell imaging

O613．71

A

1000－9965（2015）01－0001－06

10．11778／j．jdxb．2015．01．001

2014－10－09

陈文新（1978－），男，研究方向：生物纳米材料与技术

刘应亮，教授，研究方向：碳材料和发光材料．Tel：020－85221813；E-mail：tliuyl＠163．com