芒柄花素保护前脑缺血再灌注损伤中的血脑屏障并抑制神经炎症

顾民华，洪 文，唐传其，李 伟，顾 勇

（1．广州市东升医院中医科，广东广州510120；2．南方医科大学南方医院神经内科，广东广州510515）

芒柄花素保护前脑缺血再灌注损伤中的血脑屏障并抑制神经炎症

顾民华1，洪 文1，唐传其1，李 伟2，顾 勇2

（1．广州市东升医院中医科，广东广州510120；2．南方医科大学南方医院神经内科，广东广州510515）

目的：观察黄芪在脑缺血再灌注损伤模型中异黄酮成分“芒柄花素”对前脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障（BBB）的作用及抗神经炎症的效果．方法：大脑中动脉阻塞建立大鼠脑缺血模型，伊文思蓝渗透实验计算BBB通透性，原位明胶酶谱检测基质金属蛋白酶（MMPs）活性以及荧光定量PCR检测炎症因子mRNA表达．结果：芒柄花素可显著改善脑缺血再灌大鼠的神经功能缺损和BBB通透性，降低MMP-9的表达、脑内MMPs活性并减少诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素（IL-1β）等炎症因子的mRNA在缺血脑片上的表达．结论：芒柄花素具有降低脑缺血再灌注损伤中的BBB通透性和抑制神经炎症的作用．

芒柄花素；黄芪；血脑屏障；神经炎症；脑缺血再灌注

第3次中国死亡原因调查显示，脑血管病已经超过了心血管疾病和恶性肿瘤成为中国第一死亡疾病，每年死亡人数超过200万，死亡率是欧美国家的4～5倍，是日本的3．5倍［1］，具高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率等特点，严重威胁着国民的健康．急性脑卒中构成中，大约3／4属于缺血性脑卒中即脑梗死．随着人口老龄化的到来，预防和治疗脑梗死并试图提高脑梗死的医疗质量是整个医学界迫切需要解决的问题［2］．

脑梗死治疗在临床上收效甚微，主要原因之一便是在脑梗死的不同发展阶段具有不同的分子、细胞病理变化并引起更多加重病情发展的继发性损伤，发生血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）开放、脑水肿等．缺血的早期阶段BBB轻微开放，随着病情发展，BBB损伤更严重，血液中的白蛋白等成分入脑实质继发神经元死亡以及血管源性脑水肿［3－4］．因此，保护脑梗死病人的BBB损伤是治疗的一个重要策略．

基质金属蛋白酶（matrix，metalloproteinases，MMPs）的激活破坏血管周边基质和内皮细胞间的紧密连接，引起BBB开放进而发生出血转化和神经元死亡．包围在缺血中心外面的缺血半暗带接受相对低的血流灌注．低灌注诱发的剪应力、电子传递链干扰所形成的氧化应激以及低氧等因素共同启动早期的炎症反应，包括血小板聚集、小胶质细胞激活、白细胞粘附和浸润等［5］．而在亚急性期，缺血中心区组织受损后释放一类“危险相关分子模式”的细胞内含物大分子，结合相应的受体并激活炎症细胞释放多种炎性细胞因子如白介素1β（interleukin-1β，IL-1β），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）以及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthases，iNOS），从而启动继发的炎症反应［6］．脑缺血再灌注过程中的早期与继发的炎症反应可以显著地提高血脑屏障通透性，加剧神经血管单元的损伤［7］．因此，以脑梗死过程中产生的炎症反应作为治疗靶点保护血脑屏障从而改善其症状是脑梗死治疗的一个热点方向［8］．

中药黄芪来源于豆科植物黄芪（Astragalus membranaceus）的干燥块根，有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用．芒柄花素又称芒柄花黄素（formononetin，FMN）是其中一种活性成分，是异黄酮之一．有研究证实FMN具有清除自由基的作用［9］，对小鼠全脑缺血具有脑保护作用并降低脑水肿和脑内炎症［10］，体外研究表明FMN可以保护谷氨酸诱导的神经元损伤［11］．本研究探讨芒柄花素对缺血大鼠的神经功能评分、BBB通透性、MMPs表达与活性以及神经炎症等的影响．

1 材料与方法

1．1 材料

芒柄花素购买自上海永恒生物制品有限公司；单股尼龙线栓购自美国强生公司；伊文思蓝、二甲酰胺、DMSO、RIPA购自美国Sigma公司；EnzCheck胶原酶试剂盒、TRIzol购自美国Invitrogen；MMP-9购自Merck公司；β-actin抗体、羊抗鼠二抗购自Santa Cruz；ECL显影液购自GE Healthcare；IL-1β、TNF-α、iNOS和β-actin的引物从华大基因公司购买．

1．2 方法

（1）动物分组、大鼠脑缺血与再灌注模型与给药 雄性Sprague-Daweley（SD）大鼠，体质量250～270 g，购自南方医科大学实验动物中心，动物证号：SYXK（粤）2020－0056．实验大鼠30只，动物分组遵循随机原则，分为两部分：神经功能评分和伊文思蓝渗透实验的实验大鼠为15只，分别为假手术组（n＝3），溶剂对照组（n＝6），给药组（n＝6）；另外15只实验大鼠进行同样分组，用于检测MMPs活性和炎症因子表达实验．给药、造模后分别取不同冠状切面组织进行原位明胶酶谱、免疫印迹和荧光定量PCR实验（图1）．采用大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）作为脑缺血与再灌注模型［7］：大鼠经苯巴比妥麻醉后仰卧固定于手术台上，消毒，沿颈中部切开暴露颈总、颈内与颈外动脉；3／0的单股尼龙线栓从左侧颈外切口插入，经颈内动脉和前脑动脉直达底部以阻塞中动脉．假手术组除了线栓插入深度外其余与模型组一致；大鼠缺血1．5 h拔出线栓以引导血流再灌注．用药组则将FMN溶解于20 μL DMSO并在1 mL花生油中稀释．溶剂对照组含有芒柄花素外的其他等量溶剂，即20 μL DMSO于1 mL花生油中稀释，分别于缺血前15 min腹腔注射入大鼠体内质量分数为30 mg／kg．

图1 实验方案Fig．1 Experimental protocol

（2）神经功能评分 在神经功能分别在1．5与24 h进行，标准如下：无神经缺血，0分；完全伸展左前肢较困难，1分；不能伸展左前肢，2分；轻微向左转圈，3分；严重左转圈，4分；向左倾倒，5分．

（3）BBB通透性检测 通过伊文思蓝渗透实验检测BBB通透性［12］．大鼠在处死前30 min按每kg静脉注射体积分数为2%伊文思蓝2 mL，然后心脏灌注生理盐水直到流出液无颜色为止．分离缺血侧半球与二甲酰胺在60℃水浴箱中孵育24 h．用分光光度计检测上清以检测伊文思蓝的浓度从而计算BBB漏出情况．

（4）原位明胶酶谱 MMP-2和MMP-9的活性可以通过在脑组织冰冻切片上利用EnzCheck胶原酶试剂盒原位检测．前囟后0～2 mm取材切片，行原位明胶酶谱实验．冠状冰冻切片与含有质量浓度为40 μg／mL FITC-标记的DQ明胶的反应缓冲液37℃孵育2 h，明胶酶酶切DQ-gelatin而产生的肽具有自发荧光，其荧光强度即明胶酶的活性，用荧光显微镜（Zeiss，Germany）来检测所产生的荧光信号．

（5）免疫印迹（Western blotting）与定量 前囟后2～4 mm取材提取蛋白和mRNA，选取的位置包括整个缺血区、半暗带区和正常组织区，行免疫印迹和荧光定量PCR实验．脑组织蛋白经RIPA提取后定量，并在体积分数为10%SDS-PAGE中分离，转膜至PVDF、封闭后，与抗MMP-9（1∶500）或者β-actin（1∶5 000）的一抗孵育过夜．洗膜、二抗孵育（羊抗鼠，1∶2 000）、再次洗膜，然后用ECL显影液显影．所获取条带采用ImageJ软件定量．

（6）荧光定量PCR（Q-PCR） 获取脑组织后用TRIzol提取总RNA，定量、反转录获取cDNA．以cDNA为模板，加入IL-1β、TNF-α、iNOS和β-actin的引物、荧光染料等在ABI7500中进行PCR反应以对炎症因子mRNA进行定量．

（7）统计分析 数据以（均数±标准差）表示，两组数据的比较采用t检验，统计分析在SPSS 18．0统计软件中进行，P＜0．05具有统计学差异．散点图和柱状图分别由GraphPad Prism 5、OriginPro 8．5制作．

2 结果

2．1 FMN降低脑缺血大鼠的神经功能评分和BBB通透性

为了检测FMN的保护作用，首先检测了缺血再灌大鼠在给药情况下的神经功能改善情况．排除个体差异与实验误差，同时在缺血1．5与24 h两个时间点检测．假手术组（Sham）没有任何神经功能缺陷（图2A）；在缺血1．5 h后，FMN给药组和溶剂对照组（Vehicle）之间神经功能无显著差异（P＞0．05）；在缺血／再灌后24 h后，FMN给药组的神经功能评分低于溶剂对照组（P＜0．05），提示FMN具有显著的神经保护作用．

为了检测FMN对BBB通透性影响，用伊文思蓝渗透实验检测FMN给药情况下的BBB通透性．Sham组无伊文思蓝的渗漏（图2B），而缺血／再灌可以引起约质量分数为10 μg／g的漏出；相比之下，FMN给药质量浓度降低至4～8 μg／g范围内，与溶剂对照组比较具有显著差异（P＜0．01）．

2．2 FMN降低MMPs的表达活性

MMPs的激活是引起紧密连接和BBB破坏的主要蛋白酶［13］．为了探讨FMN保护BBB的分子机制，用原位明胶酶谱检测MMPs的活性以及Western blotting检测脑内MMP-9的表达．FMN显著地降低了MMPs激活所引起的酶切底物荧光强度（图3A），FMN可降低MMP-9的表达（图3B、C，P＜0．05），提示FMN给药可显著地抑制缺血再灌大鼠脑内的MMPs的活性与表达水平．

2．3 FMN降低炎症因子的mRNA表达

缺血再灌注过程中的炎症因子大量表达与释放是引起BBB破坏与MMPs激活的关键因素．用定量PCR技术检测脑内的炎症因子的表达水平，脑缺血与再灌损伤可明显增加iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA的表达，而FMN显著地降低缺血再灌大鼠脑内iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA水平（图4，P＜0．01）．

图2 FMN对脑缺血再灌大鼠神经功能评分和伊文思蓝渗漏的影响Fig．2 The effects of FMN on the neurology score and Evans blue leakage in brain ischemia-reperfused rats

图3 FMN对脑缺血再灌大鼠MMPs的活性和表达的影响Fig．3 The effects of FMN on the MMPs activity and expression in brain ischemia-reperfused rats

图4 FMN对缺血再灌大鼠脑内iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA表达的影响Fig．4 The effects of FMN on the mRNA expression of iNOS，IL－1β and TNF－α in brain ischemia-reperfused rats

3 讨论

缺血再灌注损伤过程中的神经炎症是引起血脑屏障破坏、脑水肿及神经损伤的关键因素，降低炎症反应的多种措施可以显著地保护BBB、阻止脑水肿和神经损伤．本研究结果显示，黄芪的主要成分芒柄花素非常显著地减少炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的表达、降低MMPs活性和BBB通透性、改善神经功能损伤，具有明显的神经保护作用．

研究表明黄芪提取物具有良好的神经保护作用［14］，黄芪含有上百种活性成分包括皂苷、多糖和异黄酮等［15－16］．而黄芪甲苷IV可以缩小缺血大鼠的梗塞面积和并保护BBB完整性，其作用机制与抗氧化和抗神经炎症有关［17－20］．毛蕊异黄酮和芒柄花素是黄芪中的异黄酮，二者仅相差一个羟基．毛蕊异黄酮显著地改善神经缺陷并降低梗死面积［21］．已经证实FMN对小鼠全脑缺血具有脑保护作用并可降低水肿和脑内炎症［10］．本研究结果提示，FMN可以清除显著降低iNOS、IL-1β和TNF-α炎症因子的表达并且改善神经缺损症状，FMN降低BBB通透性和MMPs活性的作用．在脑缺血再灌损伤过程中，BBB破坏可引起毒性物质从血液进入脑实质，扩大梗死面积；还可介导血管源性的脑水肿［4－6］．因此，保护BBB是阻止脑缺血再灌进一步损伤的关键治疗策略．通过伊文思蓝渗透实验，FMN可明显地降低脑卒中大鼠模型的BBB通透性．BBB开放依赖于MMPs即一组锌离子依赖的蛋白酶，在脑缺血再灌损伤中其表达和活性显著增加，降解紧密连接蛋白和环绕在内皮细胞与星形胶质细胞足板周边的基质，从而引起BBB开放［22］．本研究中Western blotting和原位明胶酶谱实验显示FMN既减少MMP-9的表达又降低MMPs的明胶酶活性，进一步证实FMN对BBB的保护作用．

总之，本研究提示FMN在脑缺血再灌损伤中的脑保护与减弱神经炎症功能，具有保护BBB的作用，为充分理解黄芪的药理活性与FMN潜在的在脑梗死治疗方面的运用提供了实验依据．

［1］卫生部新闻办公室．第三次中国死因调查主要情况［J］．中国肿瘤，2008，17（5）：344－345．

［2］赵 颖，辛秀峰，徐安定，等．关键医疗质量指标监控对提高缺血性脑血管病临床医疗质量的作用［J］．暨南大学学报：自然科学与医学版，2013，34（2）：186－190．

［3］DANEMAN R．The blood-brain barrier in health and disease［J］．Ann Neurol，2012 72（5）：648－672．

［4］GU Y，DEE C M，SHEN J．Interaction of free radicals，matrix metalloproteinases and caveolin-1 impacts bloodbrain barrier permeability［J］．Front Biosci（Schol Ed），2011，3：1216－1231．

［5］IADECOLA C，ANRATHER J．The immunology of stroke：from mechanisms to translation［J］．Nat Med，2011，17（7）：796－808．

［6］GU Y，CHEN J，SHEN J．Herbal medicines for ischemic stroke：combating inflammation as therapeutic targets［J］．Journal of Neuroimmune Pharmacology，2014，9（3）：313－339．

［7］GU Y，ZHENG G Q，XU M，et al．Caveolin-1 regulates nitric oxide-mediated matrix metalloproteinases activity and blood-brain barrier permeability in focal cerebral ischemia and reperfusion injury［J］．J Neurochem，2012，120（1）：147－156．

［8］CHEN X M，CHEN H S，XU M J，et al．Targeting reactive nitrogen species：a promising therapeutic strategy for cerebral ischemia-reperfusion injury［J］．Acta Pharmacol Sin，2013，34（1）：67－77．

［9］LO Y L，WANG W．Formononetin potentiates epirubicininduced apoptosis via ROS production in HeLa cells in vitro［J］．Chem Biol Interact，2013，205（3）：188－197．

［10］吴 虹，蔡俊杰，侯 敏，等．芒柄花黄素对脑缺血再灌注损伤小鼠炎症反应的作用［J］．四川医学，2012，33（4）：594－598．

［11］OCCHIUTO F，ZANGLA G，SAMPERI S，et al．The phytoestrogenic isoflavones from Trifolium pratense L．（Red clover）protects human cortical neurons from glutamate toxicity［J］．Phytomedicine，2008，15（9）：676－682．

［12］YU F，KAMADA H，NIIZUMA K，et al．Induction of mmp-9 expression and endothelial injury by oxidative stress after spinal cord injury［J］．J Neurotrauma，2008，25（3）：184－195．

［13］CANDELARIO-JALIL E，THOMPSON J，TAHERI S，et al．Matrix metalloproteinases are associated with increased blood-brain barrier opening in vascular cognitive impairment［J］．Stroke，2011，42（5）：1345－1350．

［14］HE X，LI C，YU S．Protective effects of radix astragali against anoxic damages to in vitro cultured neurons［J］．J Tongji Med Univ，2000，20（2）：126－127．

［15］SINCLAIR S．Chinese herbs：a clinical review of Astragalus，Ligusticum，and Schizandrae［J］．Altern Med Rev，1998，3（5）：338－344．

［16］YANG L P，SHEN J G，XU W C，et al．Secondary metabolites of the genus Astragalus：structure and biologicalactivity update［J］．Chem Biodivers，2013，10（6）：1004－1054．

［17］LUO Y，QIN Z，HONG Z，et al．Astragaloside IV protects against ischemic brain injury in a murine model of transient focal ischemia［J］．Neurosci Lett，2004，363（3）：218－223．

［18］QU Y Z，LI M，ZHAO Y L，et al．Astragaloside IV attenuates cerebral ischemia-reperfusion-induced increase in permeability of the blood-brain barrier in rats［J］．Eur J Pharmacol，2009，606（1／3）：137－141．

［19］LI M，MA R N，LI L H，et al．Astragaloside IV reduces cerebral edema post-ischemia／reperfusion correlating the suppression of MMP-9 and AQP4［J］．Eur J Pharmacol，2013，715（1／3）：189－195．

［20］LI M，QU Y Z，ZHAO Z W，et al．Astragaloside IV protects against focal cerebral ischemia／reperfusion injury correlating to suppression of neutrophils adhesion-related molecules［J］．Neurochem Int，2012，60（5）：458－465．

［21］GUO C，TONG L，XI M，et al．Neuroprotective effect of calycosin on cerebral ischemia and reperfusion injury in rats［J］．J Ethnopharmacol，2012，144（3）：768－774．

［22］KELLY M A，SHUAIB A，TODD K G．Matrix metalloproteinase activation and blood-brain barrier breakdown following thrombolysis［J］．Exp Neurol，2006，200（1）：38－49．

［责任编辑：朱颖嫄］

Formononetin protects blood-brain barrier and inhibits neuroinflammation during focal cerebral ischemia and reperfusion

GU Minhua1，HONG Wen1，TANG Chuanqi1，LI Wei2，GU Yong2
（1．Department of Chinese Medicine，Dongsheng Hospital，Guangzhou 510120，China；2．Department of Neurology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Aim：To investigate the effect of formononetin（FMN）on blood-brain barrier（BBB）permeability and neuroinflammation in a rat model of focal brain ischemia-reperfusion．Methods：Middle cerebral artery occlusion was employed to establish a brain ischemia model．Evans blue leakage assay was used to determine the BBB permeability．MMPs activity in brain sections was observed by in situ zymography．The expression of inflammatory factors was determined by fluorescent quantitative PCR．Results：FMN significantly ameliorated neurological deficits and reduced BBB permeability in the model of brain ischemia-reperfusion．Furthermore，FMN remarkably reduced MMP-9 expression，MMPs activity in the ischemic brain and decreased the mRNA expression of inflammatory factors，including inducible nitric oxide synthase，tumor necrotic factor-α and interleukin-1β．Conclusion：These results，when taken together，suggest that FMN has the effect of protecting BBB and inhibiting neuroinflammation during ischemiaand reperfusion．

formononetin；Astragali Radix；blood-brain barrier；neuroinflammation；cerebral ischemia and reperfusion

R743．3

A

1000－9965（2015）01－0034－06

10．11778／j．jdxb．2015．01．006

2014－06－19

国家自然科学基金青年项目（81400990）；湖北省协同创新中心创新团队项目子课题（2011JH－2013CXTT08）；南方医科大学“科研启动计划”青年科技培育项目（B1012158）

顾民华（1980－），女，研究方向：中医药脑保护

顾 勇，男，副研究员，医学博士；Tel：020－61641964；E-mail：yonggu＠smu．edu．cn