壬基酚对卵巢癌细胞HO8910增殖的影响*1

赵　辉　李晓梅　丁国永

(1. 泰安市出入境检验检疫局，山东 泰安　271000； 2. 泰山医学院公共卫生学院，山东 泰安　271016)

壬基酚对卵巢癌细胞HO8910增殖的影响*1

赵辉1李晓梅2丁国永2

(1. 泰安市出入境检验检疫局，山东 泰安271000； 2. 泰山医学院公共卫生学院，山东 泰安271016)

摘要：目的探讨壬基酚对卵巢癌细胞HO8910增殖的作用。方法 HO8910细胞在有酚红RPMI1640(含10%新生牛血清)培养液中常规培养，实验前1天改为无酚红RPMI1640(含5%CDT-FBS)中继续培养，1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L的NP和1×10-11mol/L的E2处理细胞24 h后，MTT法和流式细胞术检测对HO8910细胞的增殖作用。 结果1×10-5mol/L，1×10-6mol/LNP组和E2组细胞增殖率和细胞增殖指数均有明显增加。结论壬基酚对HO8910细胞发挥雌激素样作用，有促进卵巢癌细胞增殖的作用。

关键词：壬基酚；卵巢癌；增殖

壬基酚(nonylphenol,NP)作为高性价比的非离子表面活性剂，在工农业生产过程，如采矿、造纸、皮毛加工、自来水管材合成、化肥或农药中应用广泛。据统计，我国壬基酚的年使用量约为 8万t[1]，而工农业生产中排放的壬基酚，在环境中不易降解，半衰期达2~3个月，可通过食物链在生物体内蓄积[2]。有研究显示：壬基酚是雌激素类内分泌干扰物，能够干扰机体的生殖、免疫、内分泌系统，产生胚胎发育、生殖、免疫和神经毒性，具有一定的致癌性[3]。曹向可[4]等通过NP的代谢动力学研究发现，在机体各器官组织和血清中，以卵巢中的NP含量最高。NP在卵巢内的蓄积是否发挥了雌激素样作用，影响了卵巢相关疾病如卵巢癌的发病风险。本研究以NP为研究对象，探讨了NP的雌激素样作用及其对卵巢癌细胞的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1卵巢癌细胞株HO8910购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.2试剂RPMI1640培养基(有酚红和无酚红)活性炭—葡聚糖苷处理过的胎牛血清(CDT-FBS，origin: Newsland),新生牛血清，MTT，DMSO(杭州四季青生物工程材料有限公司)，雌二醇(estradiol,E2)，壬基酚(nonylphenol, NP，sigma)(SIGMA)。

1.1.3仪器CO2培养箱，超净工作台，倒置式生物显微镜，多功能酶联免疫检测仪，流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1细胞培养方法采用开放式单层贴壁培养细胞，培养液为有酚红RPMI1640(含10%新生牛血清)，培养条件为37 ℃，5%CO2，饱和湿度每2 d～3 d换一次液(或细胞传代)。加受试物前用PBS洗涤细胞，改为在无酚红RPMI1640(含5%CDT-FBS)中继续培养1 d，耗尽细胞内储存的雌激素。

1.2.2 实验分组壬基酚、雌二醇用无水乙醇溶解后加入无酚红的RPMI1640(含5%CDT-FBS)培养液中，各组终浓度如下：①溶剂对照组无水乙醇：体积含量比为0.1%。②壬基酚实验组 :1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L。③阳性对照组：雌二醇1×10-11mol/L。

1.2.3 样本处理和指标检测(1) MTT检测细胞增殖 将经无酚红RPMI1640(含5%CDT-FBS)培养1 d的HO8910细胞接种于96孔培养板(1×104个/孔)，培养箱里静置12 h，待细胞贴壁后加入各种处理因素，继续培养，每一剂量组设4个平行孔。 24 h时，镜下观察细胞数量及形态。加入MTT(5 mg/ml,20 μl/孔),继续孵育4 h,弃去培养液，每孔加DMSO150μl,以DMSO调零，在酶联免疫检测仪以490 nm波长测定各孔吸光值(A490)。计算增殖率：增殖率=(实验组A490均值—对照组A490均值)/对照组A490均值×100%。(2)流式细胞术分析细胞周期的变化：将经无酚红RPMI1640(含5%CDT-FBS)培养1 d的HO8910细胞接种于6孔培养板，前处理如上，加药24 h去掉培养液，胰酶消化后制成单细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，加入-20℃预冷的无水乙醇，调整其终浓度为75%，-20℃放置过夜固定。用预冷的PBS重悬固定后的细胞以去除乙醇，加入PI工作液(10 mg/ml,400 μl/管)，避光染色30 min，上流式细胞仪检测，计算细胞增殖指数。

1.3统计分析方法采用SPSS20.0对结果进行分析，定量资料多组均数的比较用方差分析，多实验组与一个对照组的比较用DUNNET-T检验。定性资料的比较用卡方检验，多组率两两比较时P<0.125为差异有统计学意义。

2结果

2.1形态学改变 阴性对照组细胞生长缓慢，有些细胞皱缩变小细胞凋亡，细胞出现死亡。而NP实验组与E2组细胞生长状况良好，并大量增殖，细胞之间的联系比较的紧密，形状变得不规则，呈多边形，梭状等。

图1　阴性对照组

图2　NP组

图3　E2组

2.2 MTT法检测结果与阴性对照组比较，NP各处理组与E2组的吸光度均有显著差异。结果见表1。

表1　MTT法检测NP对HO8910细胞增殖的影响

*：与阴性对照组比较P<0.05，△：与E2组比较，P<0.05

2.3流式结果 与阴性对照组比较，1×10-7组的细胞增殖指数较低，其它各处理组和E2组的细胞增殖指数均高于阴性对照组，差异有统计学意义，见表2。

表2　NP对HO8910细胞增殖周期的影响

*与溶剂对照组比较P<0.0125。

3 讨论

卵巢的癌变是一种常见且恶性程度较高的雌激素依赖性肿瘤，发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中占第3位，病死率高，严重危害广大妇女的健康。近年来，我国卵巢癌的发病率与死亡率呈上升趋势[5]，有文献报道长期接触环境雌激素可增加患卵巢癌的危险性[6]。因此，本研究选取了环境中存在较多的环境雌激素样物质壬基酚，探讨它对卵巢癌细胞株HO8910增殖的影响。实验结果显示：同E2一样，壬基酚促进了HO8910细胞的增殖和细胞DNA的合成，细胞增殖指数增加，其效应呈现量效关系，以1×10-5mol/L最强。目前，关于壬基酚致癌作用有一些报道，但与卵巢癌的关系研究不多，本次研究结果可为壬基酚与卵巢癌的关系研究奠定基础，同时也可为卵巢癌的病因预防提供方向。

参考文献：

[1]戴媛媛，牛海凤，董玉波，等，壬基酚对水生生物的毒性研究进展[J]. 环境与健康杂志，2012，29(10)：948-951.

[2]吕晓华，古燕，宋艳. 壬基酚对红鲫、草鱼和鲢鱼的毒性及组织蓄积研究[J].卫生研究，2012，41(5)：785-789.

[3]谭艳芳，陈锋.环境雌激素与激素相关肿瘤研究进展[J]. 实用预防医学，2011，18(1)：189-192.

[4] 曹向可，钱庆增，董静，等. 壬基酚在雌性大鼠体内的分布与清除[J]. 现代预防医学，2010,37(23):4418-4419.

[5]丁萍飞，张鑫培，方海平，等. 2000~2009年浙江省肿瘤登记地区卵巢癌发病与死亡分析[J]. 中国肿瘤，2014(3)：192-195.

[6]Salehi F，Dunfield L，Phillios KP，et al. Risk factors for ovarian cancer: an overview with emphasis on hormonal factors[J]. Toxical Environment Health B Crit Rev,2008,11:301-321.

基金项目：泰安市科技发展计划项目(20103003)；山东省高校科技计划项目(J10LF85)。

作者简介：赵辉(1977—)，男，山东牟平人，主治医师，研究方向：疾病病因研究。通讯作者：李晓梅(1977—)女，山东乳山人，副教授，研究方向：病因流行病学研究。E-mail:xmli@tsmc.edu.cn。

中图分类号：R730

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2015)04-0361-03

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.04.001

(收稿日期2015-1-16)

Effect of nonylphenol on ovarian cancer HO8910 cell proliferation

ZHAOHui1LIXiao-mei2DINGGuo-yong2

(1. Taian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Taian 271000，China； 2. The Public Health Institute of Taishan Medical University，Taian 271016，China)

Abstract:Objective: To investigate the effect of nonylphenol on ovarian cancer HO8910 cells proliferation. Method: HO8910 cells was maintained in RPMI1640 medium with 10%neonatal bowine serum. 1d before the beginning of the experiment ,the cells were be seeded in phenol red-free 1640 medium containing 5%charcoal dextran-treated FBS, after 1×10-5mol/L，1×10-6mol/L and 1×10-7mol/L of NP and 1×10-7mol/L E2treatment for 24 h, the proliferation of HP8910 was analyzed by MTT and flow sytometer. Results: Cell proliferation rate and Cell proliferation index increased significantly in 1×10-5mol/L，1×10-6mol/LNP groups and E2group. Conclusion: NP produce similar effects on HO8910 with E2, maybe promote the proliferation ovarian cancer cell.

Key words:nonylphenol; ovarian cancer; proliferation