丙酮酸差量法测定大蒜中大蒜辣素含量方法的建立*

朱君芳，许建，高杰

(新疆农业大学林学与园艺学院，新疆乌鲁木齐830052)

大蒜(Allium sativum L.)是百合科(Liliaceae)葱属(Allium)草本植物，是一种葱蒜类蔬菜，以鳞茎、嫩叶和花茎为食用器官，是一种重要的调味蔬菜［1］。原产于欧洲南部、西亚和中亚，西汉时期传入我国［2］。目前大蒜在我国已广泛栽培，主要产地有河南、山东、河北、甘肃、江苏及新疆等地［3-4］。

大蒜有消炎、杀菌、降低胆固醇、抗癌、以及增强免疫力等多种功效。大蒜的药用价值主要来源于大蒜辣素(allicin)。大蒜辣素极易挥发，是一种具有特殊气味的无色油状物质［5-9］。大蒜辣素以前体物质蒜氨酸存在于大蒜中，在完整的细胞中，蒜氨酸存在于细胞质中，而蒜氨酸酶存在于液泡中，细胞破碎后二者接触，继而蒜氨酸发生转化，生成大蒜辣素［10-11］。大蒜辣素药用价值大，可加工为保健品和药品等，应用前景较广阔。

目前，大蒜辣素含量的测定方法主要有气相色谱(GC)、气相色谱-质谱连用(GC-MS)、液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、硝酸汞滴定法、定硫法和分光光度计法等。其中分光光度计法不需大蒜辣素标准样品，操作简单、快速、成本低，较为实用，因此该方法的应用最为广泛［12-16］。目前，虽然关于分光光度计法测定大蒜辣素的研究很多，但相关报道却不一致，如待测指标、药品试剂、提取方法和提取条件等有所不同。由于大蒜辣素稳定性差，因此测定较为困难［14-15］。本文采用丙酮酸差量法测定大蒜鳞茎中的大蒜辣素，不需大蒜辣素标准样品，操作简单、快捷、准确性高，较为实用。

1 试验原理及材料方法

1.1 试验原理

应用曹建康［17］等测定果蔬组织中丙酮酸含量的方法，大蒜鳞茎组织提取液中所含的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼发生反应，生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，此产物在碱性环境中呈樱桃红色，并且在520 nm处有显著光吸收。该反应所呈现的颜色深浅程度与溶液中的丙酮酸含量呈正相关。

本试验中，2分子蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下，分解产生1分子大蒜辣素，同时产生2分子丙酮酸，反应式如下:

由于未经受损的大蒜鳞茎组织中含有丙酮酸，故应将大蒜鳞茎经灭酶处理，去除本底的影响，再计算得出鳞茎组织中的大蒜辣素含量。计算方法如下:

经灭酶后测得灭酶组的吸光度值分别为A1、A2、A3，测定组的吸光度值分别为A1'、A2'、A3'。可由标准曲线查得丙酮酸的质量，从而计算出丙酮酸的含量。灭酶组丙酮酸含量(即本底)为m1、m2、m3，测定组丙酮酸含量为 m1'、m2'、m3'。计算大蒜辣素生成过程中产生丙酮酸的量为M=(m1'+m2'+m3')/3-(m1+m2+m3)/3;由此得:

1.2 试验材料与试剂

市购新疆吉木萨尔县的白皮大蒜，置于(0±1)℃冷库中保存。

三氯乙酸、2，4-二硝基苯肼、氢氧化钠、丙酮酸、浓盐酸:分析纯，天津盛奥化学试剂有限公司。

1.3 试验仪器与设备

电子天平，AR2130/C 型，Pine Brook，NJ，USA;打浆机，飞利浦HR2860/60/A型，珠海飞利浦家庭电器有限公司;电热恒温水箱，-600型，上海一恒科学仪器有限公司;离心机，XYJ80-2型，江苏姜堰市医疗器械有限公司;可见光分光光度计，721型，上海菁华科技仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 丙酮酸标准曲线的制作

取6支试管，分别编号，按表1加入各种试剂。

表1 绘制丙酮酸标准曲线时各试剂加入量Table 1 The amount of each reagent drawing pyruvic acid standard curve

在上述各试管中分别加入1.0 mL 1g/L的2，4-二硝基苯肼溶液，摇匀，再加入5.0 mL 1.5 mol/L的NaOH溶液，摇匀，进行显色反应10 min。然后以0号试管为空白参比，在波长520 nm处进行比色测定，并以吸光度值为纵坐标，丙酮酸的质量(μg)为横坐标，制作标准曲线，求得线性回归方程。

1.4.2 丙酮酸差量法测定大蒜辣素条件的优化

1.4.2.1 大蒜本底中丙酮酸含量的测定及灭酶时间的优化

取完整无损伤的大蒜鳞茎鲜样约20 g，去皮，在100 ℃水浴条件下分别加热0、10、20、30、40 min 进行灭酶。然后打浆，分别取样3份，各2 g，并用80 g/L的三氯乙酸溶液定容至25 mL，摇匀。4 000×g离心10 min后可收集上清液，即为提取液。

取0.5 mL提取液于试管中，加入80 g/L的三氯乙酸溶液2.5 mL、1 g/L的2，4-二硝基苯肼溶液1.0 mL，摇匀。再加入1.5 mol/L的NaOH溶液5.0 mL，摇匀，进行显色反应10 min后，按照与制作标准曲线相同的方法，以0号试管为空白参比，在波长520 nm处进行比色测定，并记录吸光度值。

1.4.2.2 大蒜辣素最佳酶促反应时间的优化

取鲜样约40 g，打浆，将样品置于30℃水浴锅内水浴加热，进行酶促反应。分别在反应0、10、20、30、40、50、60 min时各取样 3 份，每份2 g，用80 g/L 的三氯乙酸溶液定容至25 mL，摇匀。4 000×g离心10 min后，收集上清液即为提取液。

取0.1 mL提取液于试管中，分别加入80 g/L的三氯乙酸溶液2.9 mL、1 g/L的2，4-二硝基苯肼溶液1.0 mL，摇匀。再加入1.5 mol/L的NaOH溶液5.0 mL，摇匀，进行显色反应10 min，然后在波长520 nm处进行比色测定，并记录吸光度值。

1.4.2.3 大蒜辣素最佳酶促反应温度的优化

取鲜样约20 g，重复6次，打浆均匀后分别置于20、25、30、35、40、45 ℃ 水浴锅内进行酶促反应 10 min，各取样3份，每份2 g，用80 g/L的三氯乙酸溶液定容至25 mL，摇匀。4 000×g离心10 min后，收集上清液即为提取液。

取0.1 mL提取液于试管中，加入80 g/L的三氯乙酸溶液2.9 mL、1 g/L的2，4-二硝基苯肼溶液1.0 mL，摇匀。再加入1.5 mol/L的NaOH溶液5.0 mL，摇匀，进行显色反应10 min，在波长520 nm处进行比色测定，并记录其吸光度值。

1.4.3 丙酮酸差量法测定大蒜辣素方法的评价

1.4.3.1 稳定性试验

称取无损伤的大蒜鳞茎20 g并打浆，按照试验所确定的最佳反应条件制备样品提取液。取样品提取液，按照测定条件反应完全后，分别静置0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后测定并记录吸光度值，分析吸光度值的变化情况，以评价该测定方法在一定时间段内的稳定性。

1.4.3.2 精密度试验

应用本试验所确定的最佳酶促反应条件制备样品提取液，并重复10次取该提取液，按照测定条件反应完全后，进行吸光度测定，计算出各自大蒜辣素的含量，然后计算相对标准偏差，以评价该测定方法的精密度。

1.4.3.3 重现性试验

按照最佳酶促反应条件制备大蒜鳞茎组织样品，取5份该样品，每份2 g，并制备样品提取液，分别取样品提取液并按照测定条件反应完全，然后测定吸光度，计算它们的相对标准偏差，以评价该测定方法的重现性。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

按照1.4.1的方法，以丙酮酸的质量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，建立丙酮酸测定标准曲线。丙酮酸浓度在10～50 μg/mL内与吸光度呈良好的线性关系，y=0.013 5x-0.000 4(R2=0.999 9)

2.2 丙酮酸差量法最佳测定条件的确定

2.2.1 最佳灭酶时间的确定

分别对灭酶 0，10，20，30，40 min 后的提取液进行吸光度测定，计算得出丙酮酸含量依次为354.25、72.14、68.42、69.51、69.38 mg/100g(图 1)。灭酶0 min时丙酮酸含量最高，灭酶10 min后丙酮酸含量逐渐降低，灭酶时间为20，30，40 min时丙酮酸含量趋于稳定，因此，水浴加热30 min可彻底灭酶，故本试验灭酶时间选择30 min。

图1 丙酮酸含量随灭酶时间的变化Fig.1The effect of enzyme inactivation time on content of pyruvic acid

2.2.2 最佳酶促反应时间的确定

分别在 0，10，20，30，40，50，60 min 后取样并测定吸光度值，计算可得大蒜辣素含量分别为355.56，378.11，348.98，301.00，268.14，233.82，181.01 mg/100g(图2)。大蒜鳞茎打浆10 min内，大蒜辣素含量逐渐增大，10～60 min内，大蒜辣素含量逐渐下降，由此可知，丙酮酸差量法测定大蒜辣素含量的最佳酶促反应时间为10 min。

2.2.3 最佳酶促反应温度的确定

将样品分别置于20，25，30，35，40，45 ℃水浴锅内进行酶促反应，10 min后取样，经测定、计算可得大蒜辣素含量分别为322.43，324.43，354.92，322.95，271.62，204.81 mg/100g(图3)。温度在20～30℃内，大蒜辣素含量随温度的升高而增大，30～45℃内，大蒜辣素含量随温度的升高而减小，30℃时进行酶促反应使得大蒜辣素含量最高，由此可知，丙酮酸差量法测定大蒜辣素含量的最佳酶促反应温度为30℃。该方法与朱平华［18］等在正交试验优化大蒜素的提取试验中的研究结果一致。

图2 大蒜辣素含量随酶促反应时间的变化Fig.2 Effect of enzymatic reaction time on content of allicin

图3 大蒜辣素含量随酶促反应温度对的变化Fig.3 Effect of enzymatic reaction temperature on content of allicin

2.3 丙酮酸差量法测定大蒜辣素方法的评价

2.3.1 稳定性试验

同一样品的提取液经显色反应后在不同时间段测定其吸光度，如表2所示，计算得相对标准偏差为3.409%。吸光度值减少量约0.01/0.5 h，故样品反应液的吸光度需在0.5 h内测定，即可将误差控制在0.01内，3 h后吸光度值减少0.05。因此，该试验的样品提取液经显色反应后需尽快测定吸光度值，以减少误差。

表2 稳定性试验Table 2 Results of stability experiment

2.3.2 精密度试验

对同一大蒜鳞茎组织的提取液测定10次吸光度，计算得大蒜辣素含量分别为380.17，385.47，392.74，387.25，385.61，383.22，386.79，383.69，389.09，385.74 mg/100g，计算得出平均大蒜辣素含量为385.98 mg/100g，相对标准偏差为0.88%，由此可知，该测定方法的精密度较好。

2.3.3 重现性试验

测定5份经同样处理的样品提取液的吸光度值，分别为 0.457、0.446、0.458、0.452、0.453，其相对标准偏差为1.05%，由此可知此方法具有较好的重现性。

3 结论

该方法借鉴2，4-二硝基苯肼法测定丙酮酸含量的方法，通过测定灭酶后和经酶促反应后大蒜鳞茎中丙酮酸的含量，由丙酮酸的差量计算出大蒜鳞茎中大蒜辣素的含量。

试验优化测定条件为，100℃水浴加热灭酶30 min，酶促反应温度为30℃，酶促反应时间为10 min，在520 nm处测定吸光度值，丙酮酸含量浓度在10～50 μg/mL内与吸光度呈良好的线性关系(R2=0.999 9)，精密度相对标准偏差为0.88%，重现性相对标准偏差为1.05%。由此可见，此方法耗材少，操作简单，精密度较高，重现性好，适宜测定大蒜鳞茎中大蒜辣素含量。

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