河豚鱼16S rRNA基因部分DNA序列分析及应用

陈文炳，翁国柱，陈融斌，缪婷玉，邵碧英，江树勋，彭 娟

（1.福建出入境检验检疫局技术中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境检验检疫局，福建 莆田 351100；3.集美大学水产学院，福建 厦门 361021）

河豚鱼16S rRNA基因部分DNA序列分析及应用

陈文炳1，翁国柱2，陈融斌3，缪婷玉1，邵碧英1，江树勋1，彭 娟1

（1.福建出入境检验检疫局技术中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境检验检疫局，福建 莆田 351100；3.集美大学水产学院，福建 厦门 361021）

应用16S rRNA基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增通用引物，对3 属13 种福建省搜集的河豚鱼样品与9 个未知物种的河豚鱼样品的16S rRNA基因序列中的部分片段进行PCR扩增与脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）碱基序列测定，各物种序列长度在611～614 bp之间。应用DNAMAN V6软件进行样品间DNA序列同源性比对分析，建立样品间系统关系同源树。供试13 个样品被划分为4 个类群组，群间的同源率为87%，群内同源率为94%～100%。根据序列同源性分析结果，9 个未知种名的样品被归类到3 个类群组中，推测9 个未知种名的样品为东方鲀属或腹刺鲀属。探讨了16S rRNA基因部分DNA序列测试及同源性分析技术在河豚鱼种属鉴别中应用的可能性。

河豚鱼；聚合酶链式反应；16S rRNA基因；DNA测序；物种鉴定

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增技术获得的特异性基因片段（DNA）碱基序列作为物种的特异性分子标记，在食品中动植物成分的鉴别方面已得到广泛应用[1-3]，在食品中鱼类物种成分的鉴别也有不少研究与应用[4-5]。随着基因条形码技术的发展，作为基因条形码主要DNA序列的线粒体16S rRNA与细胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）的基因序列分析越来越多地被应用于水产品的物种鉴别[6-10]。在河豚鱼物种鉴定研究领域，陈超等[11]应用随机扩增多态DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）标记对东方鲀属、红鳍东方鲀、假睛东方鲀、暗纹东方鲀和从日本引进的红鳍东方鲀4 种河豚鱼进行遗传标记鉴别与聚类分析研究。邵爱华等[12-16]对暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus）进行细胞色素b（Cytochrome b，Cyt b ）基因（Cyt b）及其侧翼tRNA基因、线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（COⅠ、COⅡ、COⅢ）3 种亚基、16S rRNA基因进行了克隆与序列分析等一系列研究。但这些研究都只局限于东方鲀属内。本实验优化并建立了河豚鱼成分的PCR检测方法、对3 个属8 个物种的河豚鱼成分进行PCR方法检测限与检出率的实验[17]，还对3 属9 种河豚鱼的Cyt b基因部分序列进行测定[18]，通过序列同源性分析，探讨样品间的同源性关系，并对应用PCR-限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和芯片生物分析系统、鉴别河豚鱼品种[19]与限制性内切酶、确证河豚鱼成分PCR检测结果等进行了探讨[20]。

本实验在13 个已知物种名称的河豚鱼的线粒体16S rRNA基因的部分DNA的PCR产物测序基础上，进行DNA序列同源性比对分析、建立样品间的系统关系树、并将9 个未知种名的河豚鱼样品16S rRNA基因的部分DNA的序列与13 个已知物种名称的样品进行同源性比对分析、推测其种属划分，为16S rRNA基因的部分DNA序列测试及同源性分析技术在河豚鱼物种鉴别中的应用提供科学依据，也为基因条形码技术在河豚鱼物种成分鉴定中的应用研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

13 个已知物种名称的河豚鱼样品来自福建省集美大学水产学院近海捕捞与厦门、莆田等水产养殖场；未知物种名称的5 个河豚鱼干样品来自福建福州沿海，4 个新鲜个体来自海南省海口市（表1）。

表1 13个已知种名与9 个未知种名的河豚鱼供试样品Table 1 The samples from 13 species and 9 unknown species of puffer fish tested in this study

1.2 试剂与仪器

十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB） 上海博亚生物技术有限公司；2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DNA MarkerⅠ 天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖 英国Oxoid公司；16S rRNA基因PCR扩增通用引物[21]序列：正向L2510-16S：5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’，反向H3059-16S：5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析仪 瑞典Amersham公司；T-Gradient梯度PCR仪 德国Biometra公司；Power Pac 1000电泳仪 美国Bio-Rad公司；GL212 PRO凝胶成像仪 美国Carestream公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取与PCR扩增

用CTAB裂解DNA提取方法[17]，以个体为测试样品进行DNA提取、PCR产物电泳。PCR扩增体系为20 μL体系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板量2 μL（200 ng/μL），双蒸水（ddH2O）6 μL；扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，反应循环35 次；最后72 ℃延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后浸于0.2% EB溶液中染色45 min，用清水漂洗，最后置于凝胶成像系统下观察结果，并拍照保存。

1.3.2 DNA碱基序列测定

用通用引物对所有收集到的共13 个河豚鱼种与9 个未知名的河豚鱼干样品（表1）进行PCR扩增。PCR扩增产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行克隆、测序，每个样品重复3 次，选用最有代表性的序列。得到的结果用DNAMAN V6进行整理分析，以.seq格式输出。

1.3.3 序列比对与同源性分析

本研究利用DNAMAN V6对各个样品所测序列进行碱基序列比对与同源性分析，比对结果以MASED Document/DNAMAN1格式输出。

2 结果与分析

2.1 部分河豚鱼的16S rRNA基因PCR扩增

从13 种河豚样品与9 个未知学名的河豚鱼干样品中提取的DNA，进行16S rRNA基因的PCR扩增，部分样品结果如图1。结果表明供试22 个样品的DNA PCR扩增是成功的，PCR产物用于序列测定。

图1 部分河豚鱼的16S rRNA基因 PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of 16S rRNA gene in puffer fish

2.2 PCR产物测序结果与序列比对

2.2.1 各样品序列的碱基基本信息

提供各样品PCR扩增产物3 个重复，经过克隆、测序，根据两端引物序列，进行整理，各样品测序结果如有差异，则选取有代表性的序列，用于结果分析，并向美国国家生物技术信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因银行（GenBank）提交。13 个已知物种名称的样品序列的基本信息统计分析结果与GenBank登录号见表2。

表2 PCR产物碱基序列的基本信息Table 2 Basic information about base sequences of PCR products

从表2可以看出，不同物种的河豚鱼的PCR扩增产物长度在611～614 bp之间，从A、C、G、T 4 种碱基的含量来看，A含量最高，在29.3%～30.5%， 其次是C与T，含量分别在23.5%～24.8%与22.9%～24.8%，G含量较低，在21.7%～23.4%之间。从各样品4 个碱基含量差异来看，黄鳍东方鲀、暗鳍腹刺鲀、月腹刺鲀、双斑东方鲀、菊黄东方鲀、铅点东方鲀6 个种的G含量最低，均在22%以下，与各自A的含量相差8%以上。黄鳍东方鲀、红鳍腹刺鲀、双斑东方鲀、菊黄东方鲀、铅点东方鲀5 个种所含碱基数均为614 个； 暗纹东方鲀、棕斑腹刺鲀、横纹东方鲀3 个种的碱基数最少，为611 个；暗鳍腹刺鲀碱基数为613 个；黑腮兔头鲀、兔头鲀、月腹刺鲀、虫纹东方鲀碱基数均为612 个。

2.2.2 已知物种样品DNA测序与序列比对分析

已知种名的河豚鱼样品PCR产物的DNA测序以.seq格式输出，再以DNAMAN V6软件进行比对，分析结果以MASED Document/DNAMAN1格式输出（图略）。从结果可知：4、6、10～12号（样品序号与表1同）等5 个样品的第39号碱基缺失；3、5、9号等3 个样品的第296号碱基缺失；1～3、5、7～9、13号等8 个样品的第388号与438～439号碱基均缺失；除了3 个片段（位置处在约第30～40号、第272～294号、第423～39号碱基）有明显的变异外，其余差异多是个别碱基的置换，可见供试河豚鱼物种间的分化主要源于碱基缺失、插入、置换等遗传变异。

图2 13个已知种样品的PCR产物序列同源树Fig.2 Phylogenetic tree based on sequence homology among 13 species known samples

基于DNA序列分析结果，建立的PCR产物序列同源树（图2）表明，13 个已知物种的样品PCR扩增片段的序列整体同源率为87%（样品号与表1同），表明尽管13 个种样品的来源于四齿鲀科（Tetraodontidae）的兔头鲀属（Lagocephalus）、腹刺鲀属（Gastrophysus）与东方鲀属（Takifugu）3 个不同的属，其保守的16S rRNA基因序列同源性仍然较高，13 个样品可划分为4组（图2），其中Ⅰ组含1号（黑腮兔头魨）、2号（兔头魨）、13号（虫纹东方鲀）3 个样品，碱基数均为612 个；Ⅱ组含3号（暗纹东方鲀）、5号（棕斑腹刺鲀）、9号（横纹东方鲀）3个样品，碱基数均为611 个；Ⅲ组含7号（暗鳍腹刺鲀）与8号样品（月腹刺鲀）2 个样品，碱基数为613与612 个；Ⅳ组含4号（黄鳍东方鲀）、6号（红鳍东方鲀）、10号（双斑东方鲀）、11号（菊黄东方鲀）、12号（铅点东方鲀）5 个样品，碱基数均为614 个。可见DNA序列的碱基个数与物种同源性有一定的关系。前3组间同源性为94%，各组内同源率在98%～100%。Ⅳ组内5 个样品之间的同源率为99%～100%，Ⅳ组与其余3组间的同源率为87%。

2.3 应用序列同源性分析推测未知样品物种归属

图3 22个样品的序列同源树Fig.3 Phylogenetic tree based on sequence homology among 22 samples

9 个未知种名的样品（序列未出示）与13 个已知种样品序列经DNAMAN V6软件的同源性比对分析，获得同源性矩阵（略）与同源树（图3）。聚类结果表明：与图2相同，22 个样品序列可划分为4组，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间同源率为94%，它们与Ⅳ组之间的同源率为86%。第Ⅰ组与图3相同，海南未知样品HNW2归到Ⅱ组，因与7号样品（暗鳍腹刺魨）同源率为99%，与8号样品（月腹刺魨）同源率为100%，推测该未知样品可能是腹刺魨属河豚鱼；有3 个福建未知种名河豚鱼样品（FJW2、FJW3、FJW5）和3个海南未知种名河豚鱼样品（HNW1、HNW3、HNW4）归到Ⅲ组，因为与3号暗鳍东方鲀、5号棕斑腹刺魨、9号横纹东方鲀的同源率在97%以上，故推测该6 个样品可能是东方鲀属或腹刺鲀属；福建未知种名样品FJW1与FJW4归到第Ⅳ组，与4号（黄鳍东方鲀）、6号（红鳍东方鲀）、10号（双斑东方鲀）、11号（菊黄东方鲀）、12号（铅点东方鲀）5 个样品的同源率为98%以上，推测该2种样品为东方鲀属河豚鱼。

3 结论与讨论

运用生物信息学专业软件DNAMAN V6，比对分析了河豚鱼16S rRNA部分片段PCR扩增产物序列。13 个已知物种名称的样品序列经DNAMAN V6软件的同源性分析，获得同源树，把13 个样品序列划分为4 组，各组内样品间同源率均为94%～100%，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间的同源率为94%，它们与Ⅳ组间同源率为87%。图2表明，1号黑腮兔头魨与2号兔头魨、7号暗鳍腹刺鲀与8号月腹刺鲀分别归为一类，与形态学分类吻合。应用同源性分析推断9 个未知种属名称的河豚鱼样品可能所属的分类单位（属）。序列比对分析发现，河豚鱼物种间的分化主要源于碱基缺失、插入、置换等遗传变异结果。但是，本研究结果发现基于序列同源性分析的类群划分与形态学分类不完全吻合，原因可能是形态学分类存在瑕疵，比如同种异名或同名异种的情况，这些情况在动植物系统分类学领域时有发生；也可能是16S rRNA序列趋向保守，一定种群内遗传变异较小，加上所获得基因信息有限，因而还无法具体鉴定到河豚鱼的物种。理论上，动植物分类标记信息包括形态学与分子遗传学标记的信息量越大，其分类定位越接近实际情况。因此，尽管16S rRNA序列趋向保守，一定种群内遗传变异可能较小，但作为重要的分子标记与遗传信息，对河豚鱼等水生生物的亲缘关系与分类的研究探讨，无疑有积极的作用[11,16,18]。当然，为了进一步判别到具体的物种，还须通过线粒体的其他基因如Cyt b、COⅠ和核糖体基因18S/28S rDNA等片段的测序，建立DNA条形码数据库，应用多种基因序列组合互相弥补缺陷，达到精准鉴别河豚鱼物种成分的目的。

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Partial DNA Sequence Analysis of 16S rRNA Gene in Puffer Fish

CHEN Wenbing1, WENG Guozhu2, CHEN Rongbin3, MIAO Tingyu1, SHAO Biying1, JIANG Shuxun1, PENG Juan1
(1. Inspection and Quarantine Technology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China; 2. Putian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Putian 351100, China; 3. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)

Partial fragments of the 16S rRNA gene of puffer fish from 13 species belonging to 3 genus collected from Fujian province and 9 samples from unknown species were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the universal 16S rRNA gene primers. The PCR products were sequenced, and the length of the obtained DNA fragments were 611-614 bp in all samples. The homology of DNA sequences among samples was analyzed with the DNAMAN V6 software, and the phylogenetic tree among samples was established. Thirteen samples were divided into 4 groups, with a homology of 87% among groups and 94%-100% between any two samples within the same group. Nine samples of unknown puffer fish species were classed into 3 groups which belonged to the Gastrophysus or Takifugu genus. The results obtained in this study can provide references for the application of 16S rRNA gene sequencing and homological analysis to identify puffer fish at genus and species levels.

puffer fish; polymerase chain reaction; 16S rRNA gene; DNA sequencing; species identification

S917.4；Q78

A

1002-6630（2015）21-0140-05

10.7506/spkx1002-6630-201521027

2015-06-30

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2013IK149）

陈文炳（1962—），男，研究员，博士，研究方向为农产品、食品分子生物学检测技术。E-mail：621213wbc@163.com