正交试验优选元宝草中总黄酮的提取工艺

·论著·

正交试验优选元宝草中总黄酮的提取工艺

龚颖珍1,2,郑承剑2,秦路平2(1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350108;2. 第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)

[摘要]目的优选元宝草中总黄酮的提取工艺。方法在单因素试验的基础上，考察乙醇浓度、料液比、提取温度等因素对元宝草中总黄酮提取率的影响，并采用L9(3)4正交试验优选最佳提取条件。结果影响元宝草中总黄酮提取率的因素顺序为乙醇浓度>料液比>提取次数>提取温度。元宝草最佳提取工艺条件为70%乙醇，提取温度60 ℃，乙醇用量20倍，提取次数3次。该条件下元宝草中总黄酮平均得率为2.38%。结论本实验设计合理、测定方法可行、实验结果可靠，为大批量从元宝草中提取总黄酮提供了理论依据。

[关键词]元宝草；总黄酮；提取工艺；正交试验

[基金项目]上海市科委中药现代化专项 (2011DZ1970502)

[作者简介]龚颖珍，硕士研究生. Tel: 13611886074；E-mail:gyz0929@163.com

[通讯作者]秦路平，教授.研究方向：生药活性物质基础及其品质评价研究.Tel:(021)81871300；E-mail:qinsmmu@126.com

[中图分类号]R93[文献标志码]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.011

[收稿日期]2013-10-17[修回日期]2014-03-17

Extraction process on total falvonoids fromHypericumsampsoniiby orthogonal experiments

GONG Yingzhen1,2, ZHENG Chengjian2, QIN Luping2(1. School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China；2. Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Abstract[]ObjectiveTo optimize the extraction technology of total falvonoids from Hypericum sampsonii.MethodsOn the basis of single factor test, solid-liquid ratio, ethanol concentration, extraction time, extraction temperature and extraction times on the extraction rate were studied by taking the content of total falvonoids as indexes. Orthogonal test was conducted to establish the extraction technology of total falvonoids from Hypericum sampsonii.ResultsThe influence degree of factors on the extraction rate of total falvonoids was in the order of ethanol concentration, solid-liquid ratio, extraction times, and temperature.The optimum extraction condition was confirmed as follows: ethanol concentration of 70%, extraction temperature of 60 ℃, and extraction times of 3×1.5 h, solid to liquid ratio of 1:20. Under this condition，the average extraction rate of total falvonoids reached 2.38%.ConclusionThe test was reasonable in design and credible in findings, and was easily operated, which could provide scientific basis for the batch extraction of total flavonoids from Hypericum sampsonii.

[Key words]Hypericumsampsonii；total flavonoids；extracting technology；orthogonal test

元宝草(HypericumsampsoniiHance)系藤黄科金丝桃属多年生草本植物，全草入药，广泛分布于我国长江流域以南各省区[1]。

近年来研究结果表明,元宝草黄酮类成分是其主要的抗抑郁活性成分之一[2]。研究者从元宝草中分离出很多黄酮类成分，其中以芒果苷为代表的呫酮类成分较多[3]。本课题组前期还从元宝草中分离出一些新的呫酮，如hypericumxanthone A[4]和sampsone C[5]等,呫酮类化合物经研究表明也具有抗抑郁活性[6]。文献[7]曾以芦丁为对照品，对元宝草总黄酮的提取工艺进行研究。而多数研究表明芒果苷在元宝草中含量较高[8，9]，笔者认为以芒果苷作为对照品进行元宝草总黄酮提取工艺考察较为合理。因此，本实验以芒果苷作为对照品，考察了元宝草全草中总黄酮的提取工艺。

本实验以总黄酮提取率为考察指标，优选元宝草中总黄酮的最佳提取工艺条件，进一步明确了元宝草中总黄酮是否具有抗抑郁活性。

1材料与仪器

1.1材料芒果苷对照品购自上海诗丹德生物技术公司，批号：05/090507, 纯度99%；元宝草全草于2012年8月购自安徽亳州，经第二军医大学药学院生药学教研室秦路平教授鉴定为金丝桃科多年生草本植物元宝草(HypericumsampsoniiHance)，选用部位为全草；NaNO2、Al(NO)3、NaOH、乙醇、甲醇均为分析纯。

1.2仪器UV5500紫外分光光度仪，旋转蒸发仪(RE-52C，上海清浦泸西仪器厂)，超声仪(USC-702，上海波龙电子设备有限公司)，粉碎机(DFY-500，上海鼎广机械有限公司)。

2方法与结果

2.1总黄酮含量的测定

2.1.1对照品溶液的制备精密称取芒果苷对照品5 mg于25 ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀，配成0.2 mg/ml的对照品溶液。

2.1.2标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.2、1.5 ml，分别置于10 ml容量瓶中，分别加入5% NaNO2溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min后各加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，再分别加入10% NaOH溶液4.0 ml，再加甲醇至刻度，摇匀，放置15 min，在366 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，标准回归曲线方程Y=35.288X-0.194 1，r=0.999 2。

2.1.3波长的选择取芒果苷标准溶液1.0 ml，按标准曲线项下操作，用UV5500紫外分光光度计进行测定，芒果苷反应产物在366、316、258 nm处有最大吸收，因316、258 nm处干扰大，因此，选择366 nm为测定波长。

2.1.4供试品溶液的制备称取5 g干燥、粉碎的元宝草全草，加入70%乙醇50 ml回流1.5 h，将提取液抽滤，滤渣在相同条件下提取1次，合并滤液定容至250 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，稀释50倍，按标准曲线项下操作，测定吸光度。芒果苷提取率(%)=(C×N×V/W) ×100，式中C为测定样品溶液中芒果苷的浓度，N为稀释倍数，V为最初样品定容体积，W为样品质量。

2.2方法学考察

2.2.1精密度实验取同一份供试品溶液，按标准曲线项下操作，重复测定5次，求得RSD=1.4%。

2.2.2稳定性实验取同一份供试品溶液，同上操作，于1、2、3、5、6 h测定吸收度，求得RSD=1.2%。

2.2.3重复性实验取同一批次元宝草药材样品，平行制备5份供试品溶液，同上操作，结果RSD=1.7%。

2.2.4加样回收率实验精密量取2 ml已测定总黄酮含量(C=0.199 53 mg/ml)的样品液9份，各分别加入芒果苷对照品溶液(0.2 g/ml)1、1、1、2、2、2、3、3、3 ml，同上操作，平均回收率为94.56%，计算RSD=2.3%。

表1　回收率实验结果( n=9)

2.3总黄酮提取工艺单因素试验

2.3.1乙醇浓度10倍量、50 ℃下提取2次，每次1 h，考察30%、40%、60%、80%、95%乙醇浓度，样品中总黄酮的提取率。结果显示，随着乙醇浓度的增加，元宝草中总黄酮的提取率先增加后降低，在80%乙醇浓度时总黄酮提取率达到最大值。

2.3.2提取时间10倍量80%乙醇，50 ℃下提取2次，考察提取时间0.5、1、1.5、2、2.5 h时样品中总黄酮的提取率。结果表明，随着提取时间的增加，样品中总黄酮的提取率逐渐增加，当提取时间增加到1.5 h后，总黄酮的提取率趋于平稳。

2.3.3料液比80%乙醇在50 ℃下提取2次，每次1.5 h，考察料液比1:5，1:10，1:15，1:20，1:25时样品中总黄酮的提取率。结果表明，当料液比为1:5时，溶剂用量过小，总黄酮提取率较低；当料液比为1:15时，总黄酮提取率最高，继续增加料液比，总黄酮提取率反而降低。

2.3.4提取温度10倍量80%乙醇，提取2次，每次1.5 h，考察提取温度40、50、60、70、80 ℃时样品中总黄酮的提取率。结果表明，温度70 ℃时，提取率最高，当温度升高，提取率趋于平稳。

2.3.5提取次数10倍量80%乙醇，50 ℃、每次1.5 h考察提取1次、2次、3次、4次时样品中总黄酮的提取率。结果表明，提取次数为2次时总黄酮提取率达到最大值，3次时平衡，随着提取次数增加，提取率稍有减少。

2.4正交试验优选总黄酮的提取工艺在单因素试验基础上，选择4个影响较显著的因素：乙醇浓度、料液比、提取次数、提取温度，以总黄酮的提取率(%)为考擦指标，按照L9(34)正交试验表进行试验，确定元宝草中总黄酮的最佳提取工艺。

表2　正交试验因素水平

表3　正交试验设计与结果

表4　SPSS方差分析表

F0.05(2,2)=19.0，1)R2=0.806(调整R2=0.720)

由表3中极差R值大小显示，各因素作用主次为：A>C>D>B，即乙醇浓度影响最大，其次是料液比和提取次数，提取温度影响最小。从表4的方差分析结果可以看出，乙醇浓度与料液比对总黄酮的提取率有较大影响(PA=2.24×10-5<0.05，PC=3.80×10-4<0.05)，而提取温度与提取次数对总黄酮的提取率影响较小(PB=0.447>0.05，PD=0.056>0.05)。因此，以A1B1C3D3为最佳提取工艺，即70%乙醇，提取温度60 ℃，乙醇用量20倍，提取次数3次。

2.5最佳提取工艺验证按最佳提取工艺条件A1B1C3D3组合进行试验，平行提取3次，总黄酮的提取率分别为2.41%、2.35%、2.38%,提取率均值为2.38%，且高于正交试验中的最高值，表明该优化条件稳定有效。

3讨论

本实验中曾采用超声、乙醇热回流、水进行提取，相比较而言，超声的提取效果好，但超声不易用于大批量工业化生产，水对黄酮的溶解度小，故本实验采用乙醇提取,具有实用性。

元宝草中黄酮类成分较多[3]，例如芦丁、2-hydroxyxanthone、芒果苷、hyperxanthone等。若采用高效液相色谱法来检测总黄酮成分，因标准品较多，不易购买，需通过分离化合物得到其他的标准品，比紫外分析法复杂；且若采用一测多评，因其相对校正因子有波动，实测值与计算值之间有误差，主要问题是由于只有内参物用到了对照品，其他待测成分无对照品，通过液-质联用等辅助才可确认，有些目标峰还不确定，相比较而言成本高、方法复杂。最终决定采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH法来检测元宝草中的总黄酮。文献[7]元宝草总黄酮的提取工艺是以芦丁为对照品，在500 nm波长处测其吸收度，由于呫酮类成分占元宝草总黄酮的比例大[3]，以芒果苷作为对照品能更好地检测元宝草中黄酮的含量，也为元宝草呫酮类成分的含量测定提供参考,本课题主要考察芒果苷和总黄酮的抗抑郁活性，则以芒果苷作对照品更有意义。

近年来研究表明，元宝草具有抗抑郁活性[10]，并可分离出较多的呫酮类成分，且现代药理学研究表明呫酮类成分也具有抗抑郁活性[6]，如芒果苷亦具有良好的抗抑郁作用[11]，这些研究结果加强了元宝草总黄酮具有抗抑郁作用的依据。本课题以芒果苷作为对照品，通过单因素和正交试验研究各因素对元宝草中总黄酮提取率的影响，筛选出总黄酮的最佳提取工艺，为大批量从元宝草中提取总黄酮提供理论依据，为以后进一步研究黄酮类成分抗抑郁活性提供参考。

【参考文献】

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[本文编辑]李睿旻