响应面法优化竹叶总黄酮的提取工艺

陈 宇，陈基棚，董映雪

（莆田学院 环境与生物工程学院，福建 莆田 351100）

竹子是禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)多年生常绿植物，研究表明，竹叶中含有大量的黄酮类化合物和其他生物活性成分，如酚酸、活性多糖、香豆素类内酯、蒽醌类化合物、特种氨基酸等[1].生物类黄酮化合物具有抗衰老、预防心血管疾病和清除自由基等生理功能[2].目前，对竹叶黄酮类物质的研究已成为一个热点，邬建敏等采用高效液相色谱法测定10种竹类的叶、枝中黄酮类化合物的含量，得出竹叶中的黄酮含量要高于竹枝中的黄酮含量[3].宋倩等[4]利用响应面法对核桃壳总黄酮的提取工艺进行优化，得到核桃壳总黄酮的最佳提取工艺：乙醇浓度59%，提取温度为78℃，液固比为33∶1，核桃壳总黄酮含量为3.61mg?g-1.晏丽等[5]采用微波辅助提取，正交法优化提取工艺，研究石榴叶总黄酮的提取工艺，结果表明:黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度80%、提取功率200W、提取时间2min、提取次数3次.

目前，国内对黄酮类化合物的提取有水提法、醇提法，而且以醇提法研究居多，采用响应面法优化竹叶黄酮的提取工艺的研究鲜有报道，为此，本研究以莆田学院校园内的竹子叶片为材料，采用响应面法优化黄酮提取工艺，为竹子的综合开发利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

竹叶（佛肚竹）采自莆田学院芳名湖畔，经烘箱60℃烘干，再用研钵研碎，过60目筛备用.

1.1.2 试剂

芦丁标准品（99%，郑州荔诺生物科技有限公司），氢氧化钠、三氯化铝、硝酸铝、亚硝酸钠、乙醇、石油醚等均为分析纯试剂.

1.1.3 主要仪器

BS224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；722型分光光度计（上海光谱仪器有限公司制造）；RE52CS-2旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DGH-9246电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；恒温水浴锅（国华电器有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 竹叶黄酮的提取工艺

称取一定量干燥的竹叶颗粒，加入一定量体积和一定量浓度的溶剂，在一定温度下加热回流提取一定的时间，过滤，滤渣用少量不同浓度溶剂洗涤合并滤液，再用旋转蒸发仪除去多余的溶剂，将所得的浓缩液用石油醚萃取多次后，取下层溶液，定容至50mL，充分摇匀备用[6].

1.2.2 黄酮含量的测定

标准曲线的绘制参照陈宇等的方法[6]，得到芦丁溶液浓度C(mg·mL-1)与吸光度A的回归方程为：A=10.114 3C-0.0096，相关系数R2为0.996.

1.2.3 响应面优化试验设计

在陈宇等[6]单因素试验的基础之上，选择乙醇浓度（A）、料液比(B)、水浴温度(C)和反应时间(D)为四个因素对竹叶黄酮类物质提取率的影响，取四个因素中较优的三个水平来作对比选用，Design-Expert V8.0.6试验设计，以竹叶的总黄酮得率为响应值，进行响应面分析试验(Box-Behnken)，试验的因素水平见表1.

表1 竹叶提取工艺响应面试验因素水平

2 结果与分析

2.1 二次响应面回归模型的建立与分析

以A、B、C、D为变量，以竹叶总黄酮提取率为响应值（Y），进行了响应面分析试验，做试验方案及结果见表2.表中1~24号是析因试验，25~29号是中心试验.29个试验点是析因点和零点，其中析因点是自变量取值在A、B、C、D所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计实验误差[7].

将实验值Y对方程的预测值Y0一一对应，拟合后得竹叶总黄酮得率的实验值与预测值对应关系的线性方程：Y=0.957X+0.034，R2=0.961.方程的斜率为0.957，方程的相关系数R2为0.961.这显示了方程的预测值与实验值符合性的比较好.

利用Design-Expert V8.0.6软件对试验结果进行多元回归拟合分析处理，得到回归方程为：

2.2 方差分析

表3可知，每一项的显著性用F值和P值显示.F值越大和P值越小，表明了该项在方程中显著性很明显.由此直接得出，最显著的项是乙醇浓度（A）项和模型的项，以及乙醇浓度的二次项(A2)、料液比的二次项（B2）、水浴温度的二次项（C2）、反应时间的二次项（D2）、乙醇浓度和水浴温度的交互项（AC）、乙醇浓度和反应时间的交互项（AD）、料液比和反应时间的交互项（BD），它们的P值均小于0.0001.其次是料液比（B）项p=0.0072.而反应时间的一次项(D)p=0.0176，稍微大于0.01和小于0.05，在此期间也表现出显著性，因此它对提取黄酮有很大的影响.

表2 提取工艺设计方案响应值及对应的预测值

表3 竹叶中总黄酮提取回归模型的方差分析

模型的显著性水平是小于0.0001，此时线性回归方程模型是极显著的，说明了该方程与实际情况拟合的比较好，更好的反映了竹叶中总黄酮的得率与乙醇浓度、料液比、水浴温度、提取反应时间的关系.

结果表明，利用水浴从竹叶中提取总黄酮，乙醇浓度的变化对黄酮提取量影响最大(p<0.0001)，料液比的影响也非常显著(p=0.0072)，反应时间的影响也相当显著p=0.0176.

2.3 响应面各因素的交互作用分析

利用Design-Expert V8.0.6软件对试验结果进行多元回归拟合分析处理，得到两个自变量的三维效应曲面图，通过响应面三维图，从而直观地反映了各各因素间的交互作用对响应值的影响，通过比较1各图可得：乙醇浓度对黄酮的提取的影响比较显著，表现为曲线较陡，提取的乙醇浓度最佳值为55%附近，提取的料液比次之，也显著，其最佳值是1g:35.8mL附近，其后是提取反应时间，最佳值是3.48h，而水浴温度比对黄酮的提取的影响不大，表现为曲线较为平滑的，随着其含量的增加或减少，它的响应值变化较小，其最佳值分别为在水浴温度72℃左右.

图1是由多元回归方程式（1）的拟合方程所做的响应曲面图.由此可对任何两因素相互影响对竹叶总黄酮的提取进行分析，以确定以总黄酮的得率为响应目标的最好的因素水平范围.

从图1-A可知，因素C水浴温度和因素D反应时间处于最佳值(分别是70℃，3h)条件下，因素A乙醇浓度和因素B料液比对提取黄酮得率的相互影响.黄酮得率响应值随着因素A和B的水平都从低到高变化，然后再降低，中间存在着一个高响应值的范围，形成了典型的二次曲面.所以，当在乙醇浓度处于48.75%-57.50%左右范围，料液比控制在1:30g.mL-1左右，可以有较高的得率.

从图1-B显示了因素B料液比和因素D反应时间在最佳值（分别是1:30g.mL-1，3h）时，因素 A乙醇浓度和因素C水浴温度对提取黄酮得率的交互影响.从三维曲面图中可知，有一个比较平缓的二次曲面，在最佳的因素B和D，因素A和B对黄酮得率影响比较平缓.

从图1-C、图1-D、图1-E、图 1-F可得，一定因素处于最佳值时，其他因素都对提取黄酮得率都有交互影响.虽然二次曲面相对于图1-A不是很明显、平缓些，但在控制每个因素时都在较高水平中.

2.4 最佳条件的预测与验证试验

为了更好的确定最佳值，从模型取值范围内选择出最低点的出发点，按模型使用快速上升法进行了优化[8]，可得知乙醇浓度55%，液料比1g:35.8mL，水浴温度是72℃，提取反应时间是3.48h.此时竹叶总黄酮的得率为1.038%.为了更好验正Box-Behnken试验设计所得出结果的合理性，采用了上述优化提取最佳条件下进行对竹叶总黄酮的水浴提取.5次平行试验平均总黄酮得率为0.996%，理论值为1.038%.总黄酮的实际值／模型最佳值=0.98，这说明此最佳模型合理有效.对Box-Behnken试验设计得出的最佳的结果具有较好的可靠性.

3 结论

本实验是水浴蒸馏法，以竹叶为原料，以芦丁为标准，Box-Behnken设计建立了4因素3水平的响应面分析，建立乙醇浓度、料液比、水浴温度、提取的反应时间与响应值总黄酮得率的交互影响的数学模型和回归方程，绘制了2个自变量的三维响应曲面图，通过目标函数的二次回归方程预测最佳工艺条件，找到整个区域上各因素的最佳组合和响应值的最佳值，从而得出最佳提取工艺条件为乙醇浓度55%，料液比1g:35.8mL，水浴温度72℃，反应时间3.48h，此条件下的黄酮得率为0.996%.总黄酮的得率的实验值和预测值相接近，水浴蒸馏法Box-Behnken设计对提取条件进行优化，回归方程的决定系数是0.9643，方程较为显著，拟合较好，精密度好，预测性较好，合理可行.

〔1〕陆志科,谢碧霞.不同种竹叶的化学成分及其提取物抗菌活性的研究 [J]西北林学院学报,2005,20(1):49-52.

〔2〕张英.竹叶黄酮的生理与药理活性[J].世界竹藤通讯,2004,2(2):1-11.

〔3〕邬建敏,贾之慎,唐云湖.竹类黄酮化合物总量及芦丁含量的测定[J].浙江农业大学学报,1998,24(4):425-428.

〔4〕宋倩,赵声兰,刘彬球,等.响应面法优化核桃壳总黄酮提取工艺的研究[J].食品工业科技,2013,34(11):214-217.

〔5〕晏丽,黄美娥,付招.微波正交法提取石榴叶总黄酮工艺[J].江苏农业科学,2010(6):403-404.

〔6〕陈宇,邓金木,林丽丽,等.竹叶总黄酮提取工艺研究[J].莆田学院学报,2012,19(2):38-41.

〔7〕李珍,哈益明,李安,等.响应面优化苹果皮渣多酚超声提取工艺研究 [J].中国农业科学,2013,46(21):4569-4577.

〔8〕王卫东,李超,崔恒薇,等.响应面法优化微波辅助提取芦笋黄酮的研究[J].中国食品添加剂,2010(6):72-76.