骨髓间充质干细胞作为携带 PEDF基因载体的可行性研究 *

骨髓间充质干细胞作为携带PEDF基因载体的可行性研究*

陈巧玲1别俊1白亦光2胡欣1文世民1李光明1

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院； 1.肿瘤治疗中心; 2. 骨科， 四川 南充 637000)

【摘要】目的探讨采用重组色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)转染小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后，评估MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性。方法Ad-PEDF在HEK293细胞中扩增、并纯化后。将其转染入MSCs(MSCs-PEDF)，用Western Blot和ELISA检测培养上清液中PEDF的表达。通过人脐静脉内皮细胞(HUVECs)成管抑制实验和迁移抑制实验来评估MSCs-PEDF表达的PEDF是否具有生理活性。结果用Ad-PEDF或Ad-LacZ转染MSCs 48小时后，用Western Blot检测细胞培养上清中的PEDF为阳性表达。ELISA检测培养上清中PEDF浓度为(78.8±4.8) ng/ml。 HUVECs成管抑制实验和迁移抑制实验显示，MSCs-PEDF的培养液上清可显著抑制HUVECs形成小管及向生长因子迁移。结论MSCs可以作为使用PEDF基因治疗肿瘤的载体。

【关键词】骨髓间充质干细胞； 色素上皮衍生因子； 基因治疗； 抗血管生成

【中图分类号】R 73-36

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.006

Abstract【】ObjectiveIn this study, we investigated the effect and mechanism of Ad-PEDF transduced MSCs and evaluated the feasibility of MSCs loaded anti-cancer gene. MethodsThe adenoviruses encoding PEDF (Ad-PEDF) were amplified in HEK293 cells and purified using the ViraTrapTM Adenovirus Purification Maxiprep Kit. MSCs were infected with Ad-PEDF and the expression of PEDF was determined by Western Blot and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The biological activity of PEDF was evaluated by HUVECs tube formation inhibition assay and migration inhibition assay. Results48 hours after Ad-PEDF or Ad-LacZ transduced, the expression of human PEDF were comfirmed by Western blot analysis and ELISA. HUVECs tube formation inhibition assay and migration inhibition assay showed that the conditioned media from MSCs-PEDF dramatically blocked the tube formation and HUVECs migration. ConclusionMesenchymal stem cells have the potential application as delivery vehicles of PEDF gene for cancer therapy.

基金项目：四川省教育厅科研项目(15ZA0216,15ZB0201)；南充市科技支撑项目(14A0017，14A0022)

通讯作者：白亦光，E-mail: baiyiguang@163.com

收稿日期：(2014-09-04； 编辑： 陈舟贵)

Study to evaluate the feasibility of mesenchymal stem cells as delivery vehicles ofPEDFgeneCHEN Qiaoling,BAI Yiguang,BIE Jun

(DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,TheSecondClinicalCollegeof

NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

【Key words】Mesenchymal stem cells; Pigment epithelium-derived factor; Gene therapy; Anti-angiogenesis

血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件[1,2]，因此，抗血管生成治疗是肿瘤治疗的一个重要部分。色素上皮衍生因子(PEDF)是已知最强的内源性血管生成抑制因子，可通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移及诱导其凋亡来发挥其抗血管生成作用[3]。重组PEDF蛋白以及病毒载体介导的PEDF基因治疗已应用于多个实验研究，并显示出治疗前景[4]。但在血浆中的半衰期较短、难以有效地到达肿瘤组织降低了可能的治疗效果。骨髓间充质干细胞(MSCs)作为一种新颖、有效的靶向肿瘤细胞的载体可能为提高PEDF的治疗效果提供一种新的策略[5]。本研究拟通过重组色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)转染小鼠MSCs后，通过人脐静脉内皮细胞(HUVECs)成管抑制实验和迁移抑制实验来评估MSCs-PEDF表达的PEDF是否具有生理活性。从而评估MSCs作为肿瘤基因治疗的载体的可行性。

1材料与方法

1.1细胞培养

1.1.1293细胞的培养将293细胞置于含有10%FBS及100U/ml阿米卡星的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2， 95%湿度条件下的孵箱中培养，以 0.25% 的胰蛋白酶消化，一般2～3天传代一次。

1.1.2人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离及培养取产后新鲜脐带15～20cm，PBS溶液多次清洗后，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端注入0.1%的胶原酶。室温下消化15分钟。 松开下端血管钳，将收集的消化液体离心(1500转/分)3min。弃去上清，用EBM-2培养基重悬，接种于培养瓶中，置于孵箱中培养。传至第2～6代的HUVECs用于后续实验。

1.1.3小鼠MSCs的分离、培养及鉴定取6～8周龄C57BL/6雌性小鼠，处死后在无菌条件下取股骨和胫骨，用低糖DMEM冲洗骨髓腔3～5次，移入无菌离心管中，离心后用含有10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，并接种于方瓶中，置于孵箱中培养。第5～8代MSCs用于后续实验。选用CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105作为其鉴定标记，对MSCs进行鉴定。

1.2方法

1.2.1PEDF重组腺病毒载体(Ad-PEDF)的扩增与纯化①Ad-PEDF的扩增：将293细胞传代培养，当其密度达到90%时，加入适量病毒上清感染细胞。约2～3天后出现细胞病变，待细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮时，收集细胞上清液至离心管中(3000转/分)，4℃离心10min，将上清液用0.45μm滤器过滤，保存于-80℃。②Ad-PEDF的PCR鉴定：用PCR电泳鉴定扩增的病毒是否带有PEDF基因，上游引物：CCCAAGCTTATGCAGGCCCTGGTGCTACTC；下游引物：CCGGATATCTTAGGGGCCCCTGGGGTC CAG。③病毒纯化与滴度测定(TCID50法)：使用Vira TrapTMAdenovirus Purification Maxiprep Kit 纯化病毒(步骤见说明书)。将293细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，将病毒液按对数级稀释(10-5～10-10)，每个浓度设置10个复孔，连续观察10天后记录每个稀释度出现CPE(致细胞病变效应)的孔数，计算细胞病变率。如果某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0。按公式计算病毒滴度：

T=101+d(s-0.5)/ml

d=Log10 of the dilution

S=Sum of ratios (start from the 10-1dilution)

将TCID50/ml转换为PFU/ml：

T = a×10bTCID50/ml = a×10b-0.7PFU/ml

1.2.2重组腺病毒体外感染MSCs加入含有适量 Ad-PEDF 重组腺病毒低糖DMEM，感染复数(MOI)=1500，摇匀，置于孵育箱中培养4小时后换液，48小时后收集感染后MSCs。同时以Ad-LacZ感染的MSCs作为对照。将Ad-PEDF、Ad-LacZ病毒转染细胞分别命名为MSCs-PEDF和MSCs-LacZ。

1.2.3检测 MSCs-PEDF 中 PEDF蛋白的体外表达①样品制备：分别加入Ad-PEDF、Ad-LacZ感染MSCs。未加病毒的MSCs作为对照。收集各组的培养液上清，采用Western blot 体外表达的PEDF蛋白进行鉴定分析，采用ELISA测定培养上清中PEDF浓度，分别测定三组培养上清中的PEDF浓度。②验证重组PEDF的生物学活性：采用人脐静脉血管内皮细胞 (HUVECs) 成管实验及迁移实验验证重组PEDF的生物学活性。

2结果

2.1　小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养和鉴定

2.1.1MSCs的原代培养原代细胞生长较慢，两周左右可长满瓶底，传代后细胞生长速度则明显加快，可得到较高纯度的MSCs。传代3次后，细胞形态较为一致，呈长梭形，多为平行排列生长或漩涡状生长，见图1。

2.1.2MSCs表面标志物的鉴定流式细胞术检测第3代MSCs上的表面标志物，CD44、CD73、CD90、CD105均呈阳性表达，而造血干细胞、内皮细胞表达的CD34、CD45则呈阴性表达，与以前文献报道一致[5,6]，见图2。

2.2重组腺病毒验证及滴度测定DNA电泳显示Ad-PEDF泳道在1200bp～1500bp之间出现一单一条带，而空载腺病毒Ad-LacZ泳道则无条带出现。说明扩增的腺病毒含有PEDF基因，见图3。

2.3Ad-PEDF转染MSCs后重组PEDF的体外表达检测转染的Ad-PEDF的MSCs(MSCs-PEDF)细胞裂解液及培养液上清在50KD处均出现一明显条带，而Ad-LacZ转染的MSCs(MSCs-LacZ)以及未转染病毒的MSCs细胞裂解液及培养液上清则未见条带出现。说明MSCs-PEDF可表达重组PEDF并分泌至细胞外。ELISA检测结果表明，MSCs-PEDF培养上清中的PEDF浓度可78.8ng/ml，而MSCs-LacZ及MSCs则仅微量表达，见图4，5。

图1原代(图a)及第3代(图b)C57BL/6小鼠MSCs(×100)

Figure 1The original generation (left) and the 3rd generation (right) MSCs of C57BL / 6 mice

图2流式细胞术分析MSCs表面标志物

Figure 2Surface markers of MSCs analyzed by flow cytometry

图3PCR验证PEDF重组腺病毒

Figure 3Ad-PEDF analyzsed by PCR

图4Western Blot分析重组PEDF的表达

Figure 4Expression of Ad-PEDF analyzed by Western Blot

注：a．细胞裂解液；b. 细胞培养液上清

图5ELISA检测细胞培养液上清中的PEDF浓度

Figure 5The concentration of PEDF analyzed by ELISA in cell culture supernatant

2.4　重组PEDF的体外活性检测

2.4.1人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)成管抑制实验MSCs-PEDF培养液上清可显著抑制HUVECs形成小管，而MSCs与MSCs-LacZ培养液上清则对成管无影响，见图6。

2.4.2人脐静脉血管内皮细胞 (HUVECs) 迁移抑制实验 HUVECs可穿过Matrigel和膜屏障向下层含有生长因子的EBM-2培养基迁移。MSCs-PEDF培养上清可显著抑制HUVECs的迁移能力，而MSCs和MSCs-LacZ培养上清则不能抑制HUVECs迁移，见图7。

3讨论

研究结果表明，MSCs-PEDF分泌的重组PEDF可通过抑制内皮细胞成管和迁移而发挥其抗血管生成活性。我们通过体外实验证明了携带有PEDF基因的MSCs在细胞裂解液及培养液中阳性表达PEDF，并且可抑制内皮细胞成管和迁移而发挥其抗血管生成活性。肿瘤进展依赖于新的血管网的生成以供给其营养[7]。血管生成在肿瘤的发生、发展及转移过程中都发挥着重要作用。如果能有效地阻止肿瘤的血管生成，就有望控制手术或放、化疗治疗后肿瘤的复发和转移。

PEDF最初是从胎儿视网膜色素上皮细胞中分离得到，而近年来，人们发现它有着强有力的抗血管生成活性，比起其他内源性血管抑制因子如：angiostatin、thrombospondin-1和endostatin 等作用更强[8]。PEDF可通过以下机制来实现其对血管生成的抑制作用：①抑制内皮细胞增殖和迁移以及形成小管。②通过Fas/FasL通路诱导内皮细胞凋亡。③下调促血管

图6MSCs-PEDF表达的重组PEDF体外抑制HUVECs形成小管

Figure 6PEDF expressed from MSCs-PEDF inhibit HUVECs form small tube in vitro

图7 MSCs-PEDF表达的重组PEDF体外抑制HUVECs迁移

Figure 7PEDF expressed from MSCs-PEDF inhibit HUVECs migration

生成因子特别是VEGF的表达，从而打破促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡[9]。以上的生理特性，奠定了PEDF应用于肿瘤治疗的基础。目前，已有大量的实验研究显示，PEDF可显著抑制肿瘤的生长和转移[10]。纯化的重组蛋白在体内易于降解，纯化困难，价格较昂贵。而以病毒或非病毒为载体的基因治疗难以在肿瘤组织内达到较高的治疗浓度。这些缺点大大降低了它们潜在的治疗效果和应用价值。因此，如何将PEDF基因有效地运送到肿瘤部位，并使其在局部持续表达是本实验今后的研究重点。

4结论与启示

骨髓间充质干细胞(MSCs)作为一种理想的细胞载体而被广泛应用于肿瘤的基因治疗。MSCs作为细胞载体的优势在于MSCs的低免疫原性可使其在宿主体内存活数百天以上并长效表达外源基因，以及MSCs具有向肿瘤组织归巢的特性。因此，MSCs是一个相对完美的运输载体，可以保护PEDF基因在循环系统中不被清除，并且也不会因为在血液中浓度过高而对其他组织造成影响，同时还可促进PEDF的治疗作用。MSCs-PEDF可定向迁移到肿瘤部位，而Ad-PEDF却没有这种能力。本实验结果提示重组PEDF腺病毒转染的MSCs能表达、分泌PEDF蛋白，可成为PEDF基因治疗肿瘤的载体。

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