耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌基因检测及同源性分析*

陆丹倩，芮勇宇，杨 秋，顾向明，邓 冲，王巧媚，邓聚辉

(1．广东省中山市中医院检验科，广东中山 528400；2.南方医科大学南方医院，广州 510515)

鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii，Ab)是一种专性需氧的非发酵革兰阴性球杆菌，属于条件致病菌，引起多重耐药并体外生存时间长(数月)，易造成流行，对其临床治疗造成较大的困难。鲍曼不动杆菌的耐药机制主要是产碳青霉烯酶水解酶，碳青霉烯酶按Ambler法，分为A，B和D三类，本文主要是中山市中医院2012～2013年临床分离出的40株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)进行B类金属酶、D类苯唑西林酶以及ERIC-PCR法聚类分析的研究，以了解我院CRAB的耐药机制及流行克隆的情况。

1 材料与方法

1.1 研究对象 40株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌来自我院2012年7月～2013年12月住院患者送检痰液29份、伤口分泌物9份、血液及尿液各1份标本，其中临床分布ICU 18株、内科10株、骨科7株及外科5株，同一患者留取初次分离菌株。

1.2 仪器及试剂 美国BD公司PhoenixTM100全自动细菌及药敏鉴定仪，PCR扩增仪器(德国Eppendorf)，凝胶成像仪(Bio-Rad)。dNTPs TaqDNA聚合酶、蛋白酶K和DNA Marker由大连瑞真生物技术有限公司提供。PCR引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、10%十二烷基磺酸钠由北京鼎国生物技术有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 细菌DNA模板制备：用SDS-蛋白酶K-酚-氯仿方法提取，加入适量缓冲液III(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA)溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。

1.3.2 PCR方法检测常见碳青霉烯酶基因：PCR分别检测B类金属酶基因NDM，VIM，IMP[1]，多重PCR同时扩增D类OXA类酶基因OXA-23-like，OXA-24-like，OXA-51-like，OXA-58-like 4个基因[2]。

1.3.3 ERIC-PCR：进行ERIC-PCR基因分型[3]。1.5 g/dl琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。利用Quantity one 软件进行ERIC-PCR图谱的分析。

2 结果

2.1 碳青霉烯酶基因检测结果 40株CRAB中，OXA-51-like阳性40株占100%，OXA-23-like阳性38株占95%，未检出NDM，VIM，IPM，OXA-24-like及OXA-58-like。电泳结果见图1。

2.2 ERIC-PCR基因分型结果 相似性聚类分析结果，40株菌相似水平大于80%(图中虚线所示)，可认为是同一克隆群。这40株菌在相似水平被聚为33个类群(克隆株)。见图2。

OXA51 OXA23

图2 ERIC-PCR基因分型电泳图谱及聚类图

3 讨论

目前，由于广谱抗菌素在临床广泛应用，导致鲍曼不动杆菌引起的感染检出率逐年升高，随多重耐药、泛耐药、全耐药的鲍曼不动杆菌的出现[4，5]，已成为全球性临床治疗的难题。鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶是它的主要耐药机制，碳青霉烯酶主要包括A，B和D三类酶，本文主要针对B类金属酶，目前常见的NDM，VIM及IPM，D类苯唑西林酶，鲍曼不动杆菌常见OXA-23-like，OXA-24-like，OXA-51-like及OXA-58-like进行检测。

本实验检测40株CAAB的结果显示以痰标本最多[6，7]，成为呼吸系统感染的主要致病菌[8]。而分布的科室主要是以ICU为主[9，10]， 这可能与ICU病区多为老年患者且住院时间长病情严重、机体免疫力差，多有严重基础疾病，大量使用广谱抗生素及各种侵入性检查和治疗等有关。

碳青霉烯酶基因检测结果显示未检出B类金属酶NDM，VIM及IPM，提示本地区鲍曼不动杆菌可能未携带此3种耐药基因。D类苯唑西林酶，检出40株OXA-51-like阳性占100%，38株OXA-23-like阳性占95%，未检出OXA-24-like及OXA-58-like。说明本地区鲍曼不动杆菌的基因型是以OXA-51-like和OXA-23-like为主，与王丽娟等[11]报道一致。OXA-51是鲍曼不动杆菌的重要标志，它是鲍曼不动杆菌的固有基因[12]， 以区别于其他不动杆菌属，水解碳青霉烯酶类药物能力较弱，并不能水解头孢菌素类药物。OXA-23能介导细菌耐碳青霉烯类药物，它是目前流行传播最广的D类碳青霉烯类基因，与国内外报道一致[13～15]。

为了了解本院近两年临床分离出的40株CRAB是否存在医院感染流行及暴发，对临床分离出的40株CRAB进行ERIC-PCR基因分型，研究其传播机制。ERIC-PCR是肠杆菌科基因重复序列为引物进行PCR扩增出多态性DNA图谱。它操作简便、快速经济、重复性较好，是研究多重耐药、泛耐药及全耐药菌传播机制的首选方法。检测的40株菌均能扩增出条带，分辨率高，40株CRAB菌相似水平大于80%(图中虚线所示)，可认为是同一克隆群。这40株菌在相似水平被聚为33个类群(克隆株)[16]。

碳青霉烯酶基因检测及ERIC-PCR基因分型的检测结果均显示，本院近两年临床分离出的40株CRAB具有高度的相似性，亲缘关系紧密，可认为是同一克隆群，提示本院存在CRAB的克隆现象可能已经发生，且携带OXA-23-like及OXA-51-like基因是引起其耐碳青霉烯类药物的主要原因之一，而且也是造成CAAB不断增加的原因。因此，应规范临床合理使用抗菌药物，加强对本地区CRAB耐药性及耐药机制的监测及关注，加强手卫生，患者隔离，环境清洁消毒等感控措施，避免在医院内的进一步传播，这对指导临床合理用药及避免CA-AB医院感染暴发流行具有重要意义。

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