硫化氢对小鼠皮肤伤口愈合的促进作用

程会军，陈明亮，孙自强，李　慧，张　磊，王　军，吉爱玲, 李彦章

(河南大学 医学院,河南 开封 475004)

硫化氢对小鼠皮肤伤口愈合的促进作用

程会军，陈明亮，孙自强，李慧，张磊，王军，吉爱玲, 李彦章*

(河南大学 医学院,河南 开封 475004)

摘要：目的研究外源性H2S对皮肤伤口愈合是否具有促进作用。方法将 C57BL/6小鼠随机分为对照组(n=10)和 H2S组(n=10)。H2S 组小鼠注射 H2S 供体硫氢化钠(NaHS)，剂量为 50 μmol/次，每天1次;对照组注射等量生理盐水(9 g/L NaCl)，每天1次；给药 10 d。给药期间每天观察两组小鼠伤口愈合情况，并在建模后第 3、7、9、11 天测量伤口大小，计算伤口面积。结果与对照组小鼠相比，硫氢化钠干预使小鼠皮肤伤口愈合时间缩短。结论H2S能促进小鼠皮肤伤口愈合。

关键词：小鼠；皮肤损伤；硫化氢；伤口愈合

中图分类号：R322.99

文献标识码：识码： A

文章编号：编号： 1672-7606(2015)01-0032-04

收稿日期：2014-12-10

基金项目：国家自然科学基金(31300884 )；河南省科技厅科技发展计划项目(132300410012)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A310020,14A310021)；河南大学科研基金项目(0000A58152,0000A58214， 0000A40566)；河南大学研究生科研创新(Y1326081, Y1326085)。

作者简介：程会军(1985-)，男，河南漯河人，在读硕士研究生，从事H2S在皮肤损伤中的作用机制研究工作。

通讯作者：*李彦章(1965-)，男，河南淅川人，博士，教授，从事肥胖和糖尿病及其并发症的教学及研究工作。

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of exogenous Hydrogen Sulfide (H2S) on skin injury in mice. MethodsEight week old male C57BL/6 mice were divided into two groups, which were subjected to skin injury (using 8 mm diameter biopsy punch). The mice from H2S group (n=10) were injected one time with NaHS (50 μmol/day) intraperitoneally (i.p.) for 10 days, while the mice from control group were administrated (i.p.) with the same amount of saline. The areas of the injury were measured on day1, 3, 5, 7, 9, and 11 after the skin injury. All mice were killed at end of the experiments. ResultsCompared to control mice，the administration of NaHS enhanced the healing of mice skin injury.Conclusion H2S could enhance the healing of skin injury.

Hydrogen Sulfide amelioed the healing of mouse skin injury

CHENG Huijun, CHEN Mingliang, SUN Ziqiang, LI Hui, ZHANG Lei, WANG Jun, JI Ailing, LI Yanzhang*

(MedicalCollegeofHenanUniversity,KaifengHenan475004,China)

Key words: mouse; skin injury; hydrogen sulfide;wound healing

皮肤是覆盖人体表面的一种重要的生理器官，具有感知、排泄以及将机体内环境与外界隔离等诸多生理功能。皮肤损伤后的修复是一个多种细胞参与的复杂过程，包括炎症反应、血管再生及表皮细胞再生等。内源性硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是继 NO 和 CO 之后发现的第 3 种新型气体信号分子[1], 在体内主要是通过细胞胱硫醚-β-合酶(cystathi-onine-beta-synthase， CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶 (cystathi-onine-gamma-lyase， CSE) 、3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercapto- pyruvzte sulfur-tansferase，3MST), 催化L-半胱氨酸而产生[2]。 目前研究[3-4]证实其存在于哺乳动物的多种组织、器官内,有神经传递、血管松弛、胰岛素分泌、细胞增生和细胞凋亡等复杂的功能。最近研究[5]表明，内源性 H2S 与皮肤烧伤中的炎症反应有关，然而，外源性 H2S 是否在皮肤伤口愈合中发挥作用还不清楚。我们的实验通过建立小鼠皮肤切割损伤模型，腹腔注射 H2S 供体 NaHS,研究外源性 H2S 对皮肤伤口愈合是否具有促进作用。

1材料和方法

1.1　试剂

硫氢化钠(NaHS)(美国 Sigma-aldrich公司)；生理盐水(石家庄四药有限公司)；脱毛膏(上海诗碧化妆品有限公司)；ABS型小动物气体麻醉机(上海玉研科学仪器有限公司)；IVC笼具(苏州冯氏)；SPF大小鼠生长繁殖饲料和 SPF 玉米芯垫料(北京科澳协力饲料有限公司)；异氟烷(河北一品制药有限公司)。

1.2　实验动物

动物实验经过河南大学实验动物管理与伦理委员会审查和批准。8 周龄 SPF级 C57BL/6 雄性小鼠，购自南京大学模式动物实验中心，饲养在 IVC笼具系统，恒温恒湿、12 h /12 h 的光明/黑暗环境中，自由获取水和食物。

1.3　实验方法

1.3.1皮肤损伤小鼠动物模型的建立小鼠随机分为对照组(n=10)和H2S组(n=10)。 使用小剪刀将小鼠背部毛发剪去，均匀涂上脱毛膏，10 min 后去除脱毛膏，清洗干净背部毛发(见图1 a)。使用打孔器(见图1 b)在背部相同的部位打两个相同大小的孔(见图1 c)。在创可贴上打一个与小鼠皮肤伤口大小相等的孔，贴到其伤口处，与伤口周围皮肤粘牢(见图1 d)，局部固定小鼠伤口周围的皮肤，使皮肤不易滑动，小鼠皮肤伤口的愈合只能依靠细胞的再生来实现。H2S 组小鼠注射 H2S 供体硫氢化钠(NaHS)，剂量为 50 μmol/次，每天1次，对照组注射等量生理盐水(9 g/L NaCl)，每天1次。给药 10 d。

1.3.2伤口面积测量和结果分析小鼠放入麻醉机吸入气体麻醉，在其伤口附近放一直尺，直尺与小鼠伤口平行。使用数码相机对伤口拍照，然后使用 NIH 的ImageJ 分析伤口的面积大小，结果用 GraphPad Prism 统计软件进行方差分析。

2结果

2.1　小鼠皮肤伤口固定和不固定的比较

小鼠皮肤伤口没有固定，伤口的形状不规则，使测量的伤口面积差别很大，并不能真实反映药物处理的效果。见图2a。伤口经固定后，能保持伤口形状不变形。见图2b。

a:变形的伤口；b:正常伤口。图2　小鼠皮肤伤口图

2.2　腹腔注射方式的优化

小鼠皮肤伤口在第 3 天其表面已经结痂(见图3 a)，如果从背部抓小鼠进行腹腔注射，很容易造成伤口的再次破裂(见图3 b)，并且这种破裂是随机的，因此会使实验结果不可靠。经过反复实验，采取抓住小鼠尾巴，让小鼠爬在笼子的铁丝网架上，快速从腹腔注射的办法可避免小鼠伤口的再次破裂。见图3c。

2.3　腹腔注射 NaHS 促进皮肤伤口的愈合

与对照组相比，H2S组的小鼠皮肤伤口面积明显要小，第3、5、7天的小鼠伤口面积相差较大，分别是7.5、8.2、7.9 mm2(表1)。第9天和第11天两组小鼠的皮肤伤口面积相差也是比较大的(见图4)，只是由于个别小鼠伤口面积没有得到很好的愈合，因此在统计上就没有显著差异(P>0.05)。见图5。

图4　小鼠皮肤伤口愈合进程

3讨论

3.1　外源性H2S促进皮肤伤口愈合的可能机制

皮肤的切割损伤是一种常见的皮肤伤害，而小的损伤可以自行修复。皮肤损伤后的修复是一个多种细胞参与的复杂过程，包括炎症反应、血管再生、表皮细胞再生等[6]。这个过程可以划分为几个阶段，在不同的阶段会产生不同的生长因子和信号分子来调控细胞的活性[7]。皮肤损伤后，首先通过凝血来填补血管的损伤处，在随后的几天，发生炎症的反应，然后是肉芽组织增生和疤痕的形成。通过研究伤口愈合的过程可阐明皮肤如何更好地恢复自身。H2S 和NO、CO一样是体内的气体信号分子，在机体的生理和病理过程中发挥重要作用[1]。通过建立小鼠皮肤切割的模型，我们研究了 H2S 在小鼠皮肤损伤中的作用。与对照组相比，腹腔内注射 H2S 供体 NaHS 能显著改善小鼠皮肤伤口的愈合速度，发现外源性 H2S 几乎可以提前1 d 使小鼠皮肤伤口愈合。H2S 是通过什么机制促进小鼠皮肤伤口愈合还不清楚，这也是我们下一步要进行研究的。我们推测外源性 H2S 可能是通过降低炎症反应和促进血管生长来实现此作用的。硫化氢可以减少炎症反应的发生，在不同的组织和疾病模型中其作用机制不尽相同。在区域性心肌缺血再灌注中，硫化氢通过增加心肌细胞中caspase9的活性来减轻损害[8]；在小胶质细胞中硫化氢通过抑制p38MAPK的活性来减轻LPS诱导的炎症反应[9]。在小鼠烧伤模型研究中，Zeng等[5]发现烧伤小鼠血浆中的 H2S 浓度降低，炎症细胞因子TNF、IL-6、IL-8水平升高，而抗炎细胞因子IL-10水平降低，说明H2S 可能通过调节免疫反应在烧伤小鼠的恢复中发挥作用。Cao等[10]发现硫化氢通过激活ATP敏感钾通道减轻UV对皮肤细胞的破坏。硫化氢在哺乳动物和其他脊椎动物中均具有舒张血管的作用。舒张的血管有利于营养物质的运输和代谢废物的排泄。除了舒张血管外，近年来还发现硫化氢会对血管的再生有促进作用[11-12]，而血管的再生对损伤皮肤的愈合具有十分重要的作用。硫化氢主要是通过akt信号通路来促进血管的再生[13]。H2S 是通过什么机制促进皮肤伤口的愈合还有待于进一步研究。

3.2　皮肤切割损伤实验中遇到的问题

在建立皮肤损伤的动物模型过程中，我们遇到了问题：①皮肤剪切损伤的收缩问题。小鼠是常见的实验动物，在皮肤损伤实验中也常用于研究伤口愈合、皮肤再生、干细胞和组织移植等。虽然小鼠在实验中最为常见和常用，但是它的皮肤和人类的皮肤相比有其显著的缺陷。小鼠的皮肤是可以移动的，而人类的皮肤和皮下组织联系比较紧密，因而小鼠皮肤愈合过程中，伤口的愈合方式与人类不太一样，其皮肤收缩起了很大的作用，而人类皮肤愈合主要是依靠细胞的再生。实验动物的姿势和动作也会对伤口的形状造成影响。因此防止伤口的收缩以及变形，使伤口的愈合完全靠细胞的增殖来实现，减少其他因素对伤口大小的影响，是皮肤损伤实验首先要解决的问题。伤口处皮肤的收缩与动物的姿势、运动等很多不确定因素有关，所以这是小鼠在皮肤切割损伤中需要解决的问题。在造成皮肤损伤后的第2天，即有伤口开始收缩，同一小鼠背部皮肤损伤面积开始变得有差异。目前解决这个的方法主要是固定伤口，有的使用伤口大小的圆环，固定在伤口边缘，使得伤口处皮肤无法向内收缩；有的使用硅胶片缝合到伤口外；这均需要找到对皮肤无刺激及过敏的材料才可实施。在实践中，我们使用了一种更为简单方便的办法来解决这个问题：在创可贴上打一个与小鼠皮肤伤口大小相等的孔，然后贴到其伤口处，使其固定。这样，小鼠伤口周围的皮肤被局部固定，便不易滑动，伤口的形状便被固定，小鼠皮肤伤口的愈合只能依靠细胞的再生来实现。②注射药物时动物固定的过程中对伤口的2次损伤问题。在研究小鼠皮肤损伤的实验中，经常需要给小鼠腹腔注射药物。但是在固定小鼠过程中，特别是在小鼠皮肤创伤后的前3 d内，抓取小鼠经常会造成皮肤伤口的2次损伤，这无疑会对实验结果造成影响，所以，固定小鼠时不能使用常用的单手握颈背部皮肤的方法。在实践中，我们先将小鼠放置在一个笼盖之上，左手捏住尾巴向后拉，待其握住笼盖的栏杆牢固后，用注射器从笼盖的栏杆缝隙中向小鼠腹腔注射药物，这样只需要抓取小鼠的尾巴便可完成药物的注射过程。这个过程不需要操作者触摸其背部皮肤，也就没有了皮肤的牵扯，不会对其伤口造成2次损伤。

参考文献：

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[责任编辑姬荷]