RP-HPLC法同时测定西洋参含片中4种成分

闫玉梅，赵梅梅，王笑笑，方佳成，廖　莎，王世祥，郑晓晖,2*

(1.西北大学生命科学学院，西安　710069；2.深圳清华大学研究院，深圳　518057)



RP-HPLC法同时测定西洋参含片中4种成分

闫玉梅1，赵梅梅1，王笑笑1，方佳成1，廖莎1，王世祥1，郑晓晖1,2*

(1.西北大学生命科学学院，西安710069；2.深圳清华大学研究院，深圳518057)

摘要：目的建立同时测定西洋参含片中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及拟人参皂苷 F11含量的RP-HPLC方法。方法色谱柱为Agilent TC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为0.5 mL·L-1磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃。 结果人参皂苷Rg1和人参皂苷Re及人参皂苷Rb1在2.5 ～ 500 μg·mL-1、拟人参皂苷F11在5.0 ～ 1 000 μg·mL-1范围内线性关系良好(r ≥ 0.999 4)；平均加样回收率均大于95.0%。结论该方法简便、准确，重复性好，可作为西洋参含片的质量控制方法。

关键词：西洋参；人参皂苷Rg1；人参皂苷 Re；人参皂苷Rb1；拟人参皂F11

西洋参为五加科植物西洋参PanaxquinquefoliusL. 的干燥根，原产于美国、加拿大，我国西洋参均为人工栽培，集中分布在吉林、辽宁、北京、陕西和山东等地。西洋参味苦，性凉，入心、肺、肾经，功能以补益为主，可滋阴降火、益气生津[1-2]。西洋参既是名贵上品中药，又是高级滋补佳品。西洋参中的主要活性成分是皂苷类成分，其中拟人参皂苷 F11是特有成分[3-6]。据报道[7-11]西洋参具有促进人体新陈代谢，抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，维护人体心、肺、肝、肾等多方面的生理保健功能。经常服用西洋参，可强身健体，延年益寿。近年来，西洋参含片作为保健食品已经被广泛使用，但对其质量控制缺乏监测。本文建立了一种同时测定西洋参含片中上述4种皂苷含量的高效液相色谱法[12]，该方法快速、准确、重复性好，为西洋参制剂的质量控制提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1100系列高效液相色谱系统(包括四元泵，DAD检测器，Agilent Chemstation工作站，美国Agilent公司)；Sartorius BP221S 万分之一电子天平；NF6000-2减压旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；KQ5200DE 型数控超声波清洗仪(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；VORTEX QILINBETER-6快速混匀器；CJB-A油浴仪；TGL-16G高速离心机(上海安宁科学仪器公司)。

1.2试药市售西洋参含片(含糖)Ⅰ(规格为900 mg/片×12片/盒×6盒)；市售西洋参含片(无糖)Ⅱ(规格为700mg/片×20片/盒×10盒)；市售西洋参无糖含片Ⅲ(规格为1 000 mg/片×12片/盒×10盒)；市售无糖西洋参含片Ⅳ(规格为700 mg/片×16片/盒×10盒)；人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷F11对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为：110703-201128，110754-201123，110704-201223，110841-200505)；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；甲醇、正丁醇、磷酸为分析纯；水为超纯水。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备分别精密称取人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷 F115.0 mg，置于5.0 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制备成质量浓度为1.0 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备精密称取供试品粉末0.25 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇12.5 mL，称定质量，置于油浴(135 ℃)中加热回流提取1.5 h，放冷，再称定质量，用水饱和的正丁醇补足减失的质量，摇匀，过滤。将滤液减压旋转蒸发挥干溶剂，残渣加入体积分数为50%的甲醇5 mL使其溶解，摇匀，过滤，9 000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.45 μm有机滤膜，4 ℃冷藏备用。

2.3色谱条件及系统适用性色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A相为0.5 mL·L-1的磷酸溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min，20%～22% B；10～30 min，22% B；30～65 min，22%～55% B；检测波长：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：50.0 μL。在上述色谱条件下，样品中人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷 F11与其他组分均达到了基线分离(R≥1.5)。见图1。

图1高效液相色谱图

A.混合对照品；B.市售西洋参含片(含糖)Ⅰ供试品；C.市售西洋参含片(无糖)Ⅱ供试品；D.市售西洋参无糖含片Ⅲ供试品；

E.市售无糖西洋参含片Ⅳ供试品；F.阴性对照品1.人参皂苷 Rg1；2.人参皂苷 Re；3.人参皂苷 Rb1；4.拟人参皂苷 F11

Fig.1HPLC chromatograms of different samples

A. mixed reference substances； B. marketedPanaxquinquefolius Tablets (with sugar) Ⅰ sample； C. marketedPanaxquinquefolius Tablet (without sugar) Ⅱ sample； D. marketedPanaxquinquefolius Tablets (without sugar) Ⅲ sample； E. marketedPanaxquinquefolius Tablets (without sugar) Ⅳ sample；1.ginsenoside Rg1；2.ginsenoside Re；3.ginsenoside Rb1；4.pseuoginsenoside F11

2.4方法学考察

2.4.1线性关系考察精密吸取2.1 项下各对照品溶液，用甲醇配制成系列质量浓度混合对照品溶液(人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1分别为2.5，12.5，25.0，50.0，125.0，250.0和500.0 μg·mL-1；拟人参皂苷 F11为5.0，25.0，50.0，125.0，250.0，500.0和1 000.0 μg·mL-1)按照拟定色谱条件进样分析。以对照品溶液质量浓度(X，μg·mL-1)对峰面积(Y)进行线性回归，结果如表1所示，说明4种组分在拟定的色谱条件下，具有较好的线性关系以及检测灵敏度。

2.4.2精密度实验精密吸取混合对照品溶液50.0 μL(含人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1均为50 μg·mL-1，拟人参皂苷 F11为125 μg·mL-1)重复进样6次，按照峰面积值计算，其相对标准偏差RSD值分别为1.0%，0.7%，0.9%和0.8%。结果表明，仪器精密度良好。

表14种成分的线性关系

Tab.1 The linear relationship of the four components

成分回归方程线性范围/μg·mL-1r人参皂苷Rg1Y=11.668X-50.3042.5～500.00.9994人参皂苷ReY=15.244X-2.89562.5～500.00.9996人参皂苷Rb1Y=9.0484X+19.0432.5～500.00.9999拟人参皂苷F11Y=3.2659X+8.09495.0～1000.00.9995

2.4.3重复性实验取西洋参制剂(市售无糖西洋参含片Ⅳ)6份，分别按照2.2 项下方法制备供试品溶液，并进行测定。人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷 F11峰面积的 RSD值分别为2.3%，2.4%，2.0%和2.3%。结果表明，样品重复性良好。

2.4.4稳定性实验在相同色谱条件下，精密吸取供试品溶液50.0 μL(市售无糖西洋参含片Ⅳ)考察其在0，2，4，6，8，10和12 h内的稳定性。人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷 F11峰面积的 RSD值分别为2.2%，2.5%，0.9%和1.9%。结果表明，供试品溶液在12 h内测定结果稳定。

2.4.5加样回收率实验精密称取已知含量的西洋参制剂(市售无糖西洋参含片IV)约0.25 g，平行6份，精密称定。分别加入4种对照品溶液适量(含人参皂苷Rg10.16 mg、人参皂苷Re 0.32 mg、人参皂苷Rb12.50 mg和拟人参皂苷F110.52 mg)，按照2.2 项下制备方法制备供试品溶液，在拟定色谱条件下进样分析，并记录峰面积，回收率实验结果见表2。人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷 F11平均回收率分别为98.5%(RSD=1.8%)，98.0%(RSD=0.9%)，99.5%(RSD=0.6%)，98.0%(RSD=1.2%)。人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷 F11的平均回收率均大于95.0%。结果表明，该方法回收率良好。

表2回收率实验结果

Tab.2 Results of the recovery test

序号加入量/mg测得量/mg回收率/%人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rb1拟人参皂苷F11人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rb1拟人参皂苷F11人参皂苷Rg1人参皂苷Re人参皂苷Rb1拟人参皂苷F1110.160.322.500.520.320.655.021.0698.8898.0699.6898.1820.160.322.500.520.330.665.041.0695.7497.2799.1597.8030.160.322.500.520.320.655.001.0498.5498.21100.08100.2840.160.322.500.520.320.654.991.0799.6599.06100.2197.5850.160.322.500.520.320.645.031.06100.8899.1599.4198.0360.160.322.500.520.330.665.071.0897.3596.7298.5596.60

2.5样品测定按照2.2项下方法制备供试品溶液，以拟定色谱条件进样50.0 μL，每批样品平行测定3次，记录峰面积，按照标准曲线法计算人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷 F11的含量。测定结果见表3。

表3样品测定结果

Tab.3 Sample determination results

±s, n=3)

3讨论

3.1色谱条件的选择

3.1.1流动相的选择对甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液等多种不同比例流动相进行比较，发现选择乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液梯度洗脱时分离效果最好。样品2 h图谱显示65 min后无特征峰出现。故选择本系统为流动相。

3.1.2检测波长的选择结合人参皂苷的吸收特征，在203 nm波长下，以乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液为流动相，C18反相色谱进行初试，再采用二极管阵列检测器(DAD)检测，全波长扫描分析，发现检测波长为203 nm时，各供试液所出的色谱峰较多，并且各色谱峰能够较好地分离，最终确定检测波长为203 nm。

3.1.3测定成分参考《中国药典》2010年版一部西洋参项下，对人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量的规定，为了更好的控制西洋参含片的质量，本实验选择对其主要有效成分人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及特征性成分拟人参皂苷 F11的含量进行测定，结果表明，该方法对人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷 F11的测定简便易行，可以作为西洋参含片质量控制的参考方法。

3.2提取方法[13]本实验所用提取条件在参考《中国药典》的基础上，经过多次优化而确定。分别以水饱和的正丁醇、体积分数为50%，70%和100%的甲醇将0.25 g样品溶于圆底烧瓶中，加热回流1.5 h，结果表明，水饱和的正丁醇提取的4种成分的含量最高。同时对提取时间进行了考察，分别回流提取1.0，1.5和2.0 h，结果表明，2.0与1.5 h提取结果基本一致，最终以水饱和的正丁醇加热回流提取1.5 h为最佳提取方法。

4结论

从结果可知，西洋参含片中人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1与特征性成分拟人参皂苷F11的含量存在一定差异。西洋参制剂中的4种皂苷总含量范围在0.54%～1.40%，其中人参皂苷Rg1在0.02%～0.07%范围内，人参皂苷 Re在0.012%～0.13%范围内，人参皂苷 Rb1在0.37%～1%范围内，拟人参皂苷 F11在0.08%～0.30%范围内。比较发现所测西洋参制剂中人参皂苷 Rb1含量较高，拟人参皂苷 F11次之。比较市售4个厂家生产的西洋参含片中4种指标成分的含量，发现存在一定差别，其中市售无糖西洋参含片IV中4种指标成分的含量最高，其次是市售无糖西洋参含片II含量较高。

本实验采用HPLC法同时测定西洋参含片中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和拟人参皂苷F11的含量，节省了分析时间，减少了溶剂的使用量和样品的进样量，同时该方法精密度、稳定性和回收率良好，可用于西洋参制剂的鉴别和质量控制。

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Simultaneous determination of four components inPanaxquinquefoliusL. Tablets by RP-HPLC

YAN Yumei1，ZHAO Meimei1，WANG Xiaoxiao1，FANG Jiacheng1，LIAO Sha1， WANG Shixiang1，ZHENG Xiaohui1,2*(1. College of Life Sciences，Northwest University，Xi′an 710069，China；2. Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen，Shen-zhen 518057，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for simultaneous determination of four components in Panax quinquefolius L. Tablets ，including gensenoside Rg1， gensenoside Re，gensenoside Rb1and pseuoginsenoside F11. MethodsThe analysis was performed on an Agilent TC-C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm) with 0.5 mL·L-1phosphoric acid-acetonitrile with step gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1with detection wavelength of 203 nm. The column temperature was kept at 30 ℃. ResultsThe ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1and pseuoginsenoside F11showed good linear relationship in the ranges of 2.5-500.0，2.5-500.0，2.5-500.0 and 5.0-1 000.0 μg·mL-1，respectively. All of the average recovery rates were more than 95.0%. ConclusionThis method is simple，accurate，reliable and reproducible. It can be used for the quality control of Panax quinquefolius L. Tablets.

Key words:Panax quinquefolius L.；gensenoside Rg1；gensenoside Re；gensenoside Rb1；pseuoginsenoside F11

收稿日期：(2015-07-17)

通信作者：*郑晓晖，男，教授

作者简介：闫玉梅，女，在读硕士研究生

基金项目：国家自然科学 (编号：81303185)；陕西省重点科技创新团队计划(编号：2013KCT-24)；高等学校博士学科点专项科研基金项目(编号：20136101120030)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)01-0005-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.002