蚕沙和稻秸不同比例组合对瘤胃微生物体外发酵的组合效应

孙丽莎 李华伟 崔慧慧 赵 睿 王梦芝 喻礼怀 王洪荣（扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009）

蚕沙和稻秸不同比例组合对瘤胃微生物体外发酵的组合效应

孙丽莎 李华伟 崔慧慧 赵 睿 王梦芝 喻礼怀 王洪荣∗
（扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009）

摘 要：本文采用瘤胃微生物体外发酵法研究了不同比例蚕沙（SE）和稻秸（RS）的组合效应。试验将SE：RS设计为100∶0（SE100组）、80∶20（SE80组）、60∶40（SE60组）、40∶60（SE40组）、20∶80（SE20组）、0∶100（SE0组）的比例，分别进行体外发酵批次培养24 h和体外发酵产气培养72 h，测定产气参数和发酵特性指标。结果表明：1）SE100组理论最大产气量显著高于其他各组（P＜0．05），SE80组的24和72 h累积产气量显著高于其他组（P＜0．05）。2）24 h时培养液总挥发性脂肪酸浓度为SE80组＞SE100组＞SE60组＞SE40组＞SE0组＞SE20组，乙酸／丙酸为SE80组＜SE40组＜SE20组＜SE60组＜SE0组＜SE100组。3）24 h时培养液的微生物蛋白浓度SE20组＞SE100组＞SE60组＞SE80组＞SE40组＞SE0组。4）随着蚕沙比例的升高，底物体外有机物消化率越高。5）SE80组多项指标组合效应指数为0．76，SE80组＞SE40组＞SE60组＞SE20组。蚕沙和稻秸组合改善了体外瘤胃微生物发酵特性和产气参数，且蚕沙和稻秸的最佳比例为80∶20。关键词：蚕沙；稻秸；体外发酵；组合效应

我国南方蚕桑副产物资源丰富，蚕沙（silk⁃worm excrement，SE）是在养蚕生产中蚕粪与蚕食桑后剩下的桑渣的混合物。郭春华等［1］研究表明，蚕沙干物质中粗蛋白质（CP）和粗纤维含量分别为13．03%和17．37%，与山羊饲粮营养水平相当，是一种优质的山羊饲料。稻秸（rice straw，RS）是我国南方的主要农作物秸秆，稻秸木质化程度高，适口性差，采食量和消化率偏低。饲粮的组合效应实质上是指来自不同饲料源的营养性物质、非营养性物质以及抗营养物质之间互作的整体效应［2］。Tan等［3］研究表明，肉牛饲喂稻秸时添加桑叶能显著提高干物质采食量、瘤胃液氨氮（NH3⁃N）浓度和纤维素分解菌数量，从而改善瘤胃内环境。在秸秆与其他粗饲料的组合饲喂方面，国内外学者的研究主要集中在秸秆与豆科牧草、青绿饲料和甜菜渣等多汁粗饲料的组合方面，结果发现秸秆与上述饲料组合，能提高反刍动物对粗饲料的采食量和消化率［4－5］。有研究表明，在山羊［6－7］、兔［8］饲粮中添加一定比例的蚕沙，不但可以降低饲粮成本，而且还能提高生长速率，增加养殖经济效益。但是，目前国内外关于蚕沙与秸秆组合对反刍动物的影响还没有讨论。因此，本文以蚕沙和稻秸组合在体外瘤胃发酵产气参数和特性指标，利用多项组合效应找出最佳组合比例，旨在探求南方经济作物副产物蚕沙的有效利用以及蚕沙和低质秸秆饲料的有效饲喂方式。

1　材料与方法

1．1 试验材料

蚕沙从江苏姜堰养蚕农业示范区收集，稻秸为收获稻谷后的晚稻秸，65℃烘干后粉碎过40目筛保存，测定常规营养水平。

1．2 瘤胃液供体动物

选3只体况良好、体重相近、安装有永久性瘤胃瘘管的健康绵羊为瘤胃液供体。试验瘘管羊饲粮配制参照NRC（2003）。组成：玉米30．0%，豆粕12．5%，麦麸5．0%，羊草37．5%，苜蓿10．0%，食盐1．0%，预混料4．0%。营养水平：代谢能11．31 MJ／kg，CP 13．69%。代谢能为维持需要的1．2倍，精粗比为30∶70，日喂2次（08：30和18：00）、自由饮水、常规光照。

1．3 人工瘤胃体外发酵

1．3．1 瘤胃液的采集与分配

在瘘管羊早饲前，利用自制真空负压装置，3只瘘管羊分别采集瘤胃液300 mL，经2层纱布过滤，装入保温瓶，通CO2，置于39℃水浴中保温。

1．3．2 体外发酵产气培养（72 h）

本试验采用单因子试验设计，将蚕沙和稻秸（SE：SR）设计为100∶0（SE100组）、80∶20（SE80组）、60∶40（SE60组）、40∶60（SE40组）、20∶80 （SE20组）、0∶100（SE0组）的比例，不同比例蚕沙与稻秸组合的主要营养成分见表1。称取混合底物0．5 g于不同标号的发酵瓶（100 mL）中紫外灭菌30 min，分别加入人工唾液40 mL（事先通CO2至饱和，于39℃水浴30 min），再分别加入混合瘤胃液20 mL，塞好橡皮塞，通过进气通道通入混合气体至饱和，于64通路AGRS－Ⅲ型体外发酵产气自动记录系统中培养［9］，培养过程中产气量自动记录，39℃恒温条件下连续培养72 h，期间每12 h轻轻晃动发酵瓶。设1个空白组，即无底物的瘤胃液与人工唾液的混合液。每组设置4个重复。

表1　不同比例蚕沙与稻秸组合的主要营养成分（风干基础）Table 1 Main nutrient levels of different combinations of SE and RS（air⁃dry basis）　%

1．3．3 体外发酵批次培养（24 h）

按照1．3．2步骤配制缓冲液和称取样品，在SHA－A恒温振荡水浴锅中进行微生物发酵24 h，设1个空白组，即无底物的瘤胃液与人工唾液的混合液，每种混合底物设置15个重复，每次取出3个发酵罐。分别在培养开始后0、3、6、9、12、24 h取样［10］，每次取10 mL，分装于2只5 mL的离心管中，－20℃冷冻保存，用于微生物蛋白（MCP）和挥发性脂肪酸（VFA）浓度的测定。将3个发酵终止后残留物过滤、洗涤、烘干称量后，然后转入烘干的坩埚于马福炉中（620±2）℃烘至恒重，用于测定体外有机物消化率（IVDOM）。

1．4 指标测定与方法

1．4．1 产气量和产气参数的计算

根据公式数据模型进行非线性回归拟合：

式中：GPt为底物发酵在t时间点的发酵累计产气量（mL／g DM）；A为体外发酵理论最大产气量（mL／g DM）；B为曲线拐点参数；C为达1／2理论最大产气量的时间（h）。

1．4．2 MCP和VFA浓度的测定

参照Wang等［12］的方法进行微生物分离和MCP浓度的测定。总挥发性脂肪酸（TVFA）、乙酸、丙酸、丁酸浓度采用气相色谱按Khorasani等［13］的方法测定；TVFA浓度是乙酸、丙酸、丁酸浓度之和。

1．4．3 IVDOM的计算

式中：m0为样品重（g）；m1为坩埚重（g）；m2为空白样残渣重（g）；m3为坩埚＋样品残渣重（g）。

1．4．4 组合效应的计算

单项组合效应指数（SFAEI，%）＝

100×（实测值－理论值）／理论值［15］；组合效应综合指数（MFAEI，%）＝∑SFAEI＝

式中：实测值为实际测量的值；理论值＝SE测定值×SE比例（%）＋RS测定值×RS比例（%）。

1．5 数据统计分析

基本处理采用Excel软件，数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 18．0软件中compare mean 的one⁃way ANOVA过程进行单因素方差分析，对产气量、产气参数数据进行有重复单因素方差分析，对组合效应值进行t检验。

2　结 果

2．1 不同比例蚕沙和稻秸组合对72 h体外发酵产气参数的影响

由表2可知，SE100组的理论最大产气量显著高于其他组（P＜0．05），各底物发酵后，SE0组的理论最大产气量是最低的。SE80组在24和72 h的累积产气量显著大于其他组（P＜0．05）。SE80、SE60、SE40组达1／2理论最大产气量的时间差异不显著（P＞0．05），SE80和SE60组显著大于SE20组（P＜0．05）。24 h累积产气量为SE80组＞SE100组＞SE40组＞SE60组＞SE20组＞SE0组，72 h累积产气量为SE80组＞SE100组＞SE60组＞SE20组＞SE40组＞SE0组，组间差异均显著（P＜0．05）。

2．2 不同比例蚕沙和稻秸组合对24 h体外发酵特性的影响

由表3可知，不同比例蚕沙和稻秸组合在体外培养过程中对TVFA浓度呈现先上升后下降又上升的趋势，在9、12 h时各发酵底物组均出现下降趋势。24 h时培养液TVFA浓度为SE80组＞SE100组＞SE60组＞SE40组＞SE0组＞SE20组，SE40组与SE60组差异不显著（P＞0．05），SE0组与SE20组差异不显著（P＞0．05），其余各组间差异均显著（P＜0．05）。培养液乙酸／丙酸随着时间的延长呈现先下降后上升又下降的趋势。在24 h时，乙酸／丙酸为SE80组＜SE40组＜SE20组＜SE60组＜SE0组＜SE100组，组间没有显著差异（P＞0．05），且都低于12 h时的乙酸／丙酸。

表2　不同比例蚕沙和稻秸组合对72 h体外发酵产气参数的影响Table 2 Effects of different combination ratios of SE and RS on gas production parameters of 72 h in vitro fermentation

由表4可知，整体的MCP浓度动态趋势是先上升后下降的。在9 h时，SE100、SE40和SE60组的MCP浓度较高，显著高于SE20和SE0组（P＜0．05）。在24 h时，SE20组＞SE100组＞SE60组＞SE80组＞SE40组＞SE0组，但是除SE0组与各组差异显著（P＜0．05）外，其他组间均差异不显著（P＞0．05）。

2．3 不同比例蚕沙和稻秸组合对24 h体外发酵IVDOM的影响

由表5可知，随着蚕沙比例的升高，IVDOM升高，并且SE80和SE100组在除9 h外的各时间点的IVDOM没有显著差异（P＞0．05），说明蚕沙在培养液中发酵效果很好，瘤胃微生物的活力强，蚕沙和稻秸的组合效应增加了IVDOM。

表3　不同比例蚕沙和稻秸组合对24 h体外发酵VFA浓度的影响Table 3 Effects of different combination ratios of SE and RS on VFA concentration of 24 h in vitro fermentation

表4　不同比例蚕沙和稻秸组合对24 h体外发酵MCP浓度的影响Table 4 Effects of different combination ratios of SE and RS on MCP concentration of 24 h in vitro fermentation　mg／mL

表5　不同比例蚕沙和稻秸组合对24 h体外发酵IVDOM的影响Table 5 Effects of different combination ratios of SE and RS on IVDOM of 24 h in vitro fermentation　%

2．4 不同比例蚕沙和稻秸的组合效应指数

由表6可知，蚕沙和稻秸组合在瘤胃微生物体外发酵过程中都发生了正组合效应，特别蚕沙比例达到80%时。SE60组与SE40组的MFAEI接近，且SE80组＞SE40组＞SE60组。

表6　不同比例蚕沙和稻秸的组合效应指数（24 h）Table 6 Associative effect indexes of different ratios of SE and RS（24 h）

3　讨 论

3．1 蚕沙和稻秸组合对培养液产气量的影响

饲粮中所含有的可发酵有机物含量越高，微生物活性越大，产气量就会越高。达1／2理论最大产气量的时间与微生物产量最大时的时间相近。本试验中，蚕沙的比例越高，达1／2理论最大产气量的时间越长，理论最大产气量越高，24和72 h的CP SE80组显著大于其他各组。碳水化合物及CP作为底物发酵时的主要产气来源物质，直接影响着底物在体外培养时的产气发酵特性。郭春华等［1］研究表明，蚕沙CP瘤胃有效降解率为45．47%，低于秸秆类饲料，而粗纤维的有效降解率为36．05%，高于秸秆类饲料。说明蚕沙给稻秸提供了足够的碳源、氮源和一些必需的矿物质元素，促进了瘤胃发酵。混合饲粮中易发酵的营养成分和不易发酵的结构性碳水化合物的比例比单一饲料合理，因而更容易被瘤胃微生物利用，更适合微生物的生长。

3．2 蚕沙和稻秸组合对培养液VFA含量的影响

李兵［16］研究表明，随着尿素氨化处理水平的提高，TVFA浓度增加，说明氨化处理对稻草的微生物发酵是有益的，氨化处理能够提高稻草的CP含量，提高了稻秸消化率，丙酸是反刍动物体内主要的生糖物质，促进丙酸生成有利于提高动物的生产性能。本试验中，随着蚕沙比例的提高，TV⁃FA浓度都呈增长趋势，乙酸／丙酸随时间的增加也有减小趋势，蚕沙CP含量为16．80%，NDF含量为34．30%，ADF含量为17．60%（表1），说明蚕沙中可消化碳水化合物含量较高，微生物活性较大，从而TVFA浓度较高。这也与张倩等［17］和刘大程等［18］的试验结果一致。

3．3 蚕沙和稻秸组合对培养液MCP浓度的影响

MCP是反刍动物最主要的氮源供应者。当瘤胃中氨和能量不同步释放，可导致可发酵底物利用率下降和MCP合成量减少［19］。MCP浓度不仅能间接地反映出微生物种群的数量，还能体现培养体系中微生物利用NH3⁃N的能力。各组发酵24 h的MCP浓度相对于发酵12 h的MCP浓度减少，原因可能是本试验发酵底物只是单纯的粗饲料组合，这些底物的可发酵碳水化合物偏少，限制了微生物的活性和对NH3⁃N的摄取和转化。这与李袁飞等［20］的结果一致。

3．4 蚕沙和稻秸的组合效应

Menke等［21］提出体外发酵气体产量同IV⁃DOM高度相关，即产气量越高，饲料在瘤胃内的发酵程度越高。本试验中，稻秸的IVDOM很低，但随着蚕沙比例的提高，组合饲草的IVDOM越高，产气量也随着增大，但是24和72 h的累积产气量为SE80组＞SE100组，说明蚕沙和稻秸存在正组合组合效应。卢德勋［22］提出用MFAEI将人工瘤胃产气各时间点所测得各项指标综合后评定饲料间的组合效应。因此本试验综合考虑累积产气量、IVDOM、MCP、VFA几个因素。对蚕沙和稻秸组合进行体外发酵筛选，得出MFAEI，试验的最优组合为SE80组。

4　结 论

通过对蚕沙和稻秸组合效应的研究，二者组合改善了体外瘤胃微生物发酵特性和产气参数，且蚕沙和稻秸的最佳比例为80∶20。

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（编辑 王智航）

Associative Effects of Different Combination Ratios of Silkworm Excrement and Rice Straw on the Rumen Microbial Fermentation in Vitro

SUN Lisa LI Huawei CUI Huihui ZHAO Rui WANG Mengzhi YU Lihuai WANG Hongrong∗（College of Animal Science and Technology，University of Yangzhou，Yangzhou 225009，China）

∗Coressoponging author，professor，E⁃mail：hrwang＠yzu．edu．cn

Abstract：In vitro fermentation was conducted to investigate associative effects of different combination ratios of silkworm excrement（SE）and rice straw（RS）．SE and RS were mixed at the ratios of 100∶0（SE100 group），80∶20（SE80 group），60∶40（SE60 group），40∶60（SE40 group），20∶80（SE20 group）and 0∶100 （SE0 group），respectively．The mixtures were incubated in vitro for 24 hours for a batched in vitro fermenta⁃tion test and 72 hours for an in vitro fermentation gas production test．Gas production parameters and fermenta⁃tion characteristics were determined．The results showed as follows：1）theological maximum gas production in SE100 group was significantly higher than that of the other groups（P＜0．05），and accumulated gas production of SE80 group was significantly higher than that of the other groups（P＜0．05）．2）Total volatile fatty acid concentration in culture medium at 24 hours showed SE80 group＞SE100 group＞SE60 group＞SE40 group＞SE0 group＞SE20 group，and acetate／propionate showed SE80 group＜SE40 group＜SE20 group＜SE60 group＜SE0 group＜SE100 group．3）Microbial protein concentration in culture medium at 24 hours showed SE20 group＞SE100 group＞SE60 group＞SE80 group＞SE40 group＞SE0 group．4）With the increasing of SE ratio，in vitro digestion rate of organic matter of substrate was increased．5）Multiply factor associative effect index of SE80 group was 0．76，and showed SE80 group＞SE40 group＞SE60 group＞SE20 group．In conclusion，the combina⁃tion of SE and RS can improve in vitro fermentation characteristics and gas production parameters，and the op⁃timal ratio of SE and RS is 80∶20．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（1）：313⁃319］

Key words：silkworm excrement；rice straw；in vitro fermentation；associative effect

通信作者：∗王洪荣，教授，博士生导师，E⁃mail：hrwang＠yzu．edu．cn

作者简介：孙丽莎（1989—），女，河南商丘人，硕士研究生，研究方向为反刍动物营养代谢与调控。E⁃mail：106351286985＠qq．com

基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项“南方地区肉羊育肥与高品质肉生产技术研究”（201303144）；扬州大学动物营养与饲料科学优势学科专项；江苏省科技支撑计划（BE2013393）

收稿日期：2014－07－21

doi：10．3969／j．issn．1006⁃267x．2015．01．038

文章编号：1006⁃267X（2015）01⁃0313⁃07

文献标识码：A

中图分类号：S816