兔骨缺损模型构建的研究进展*

芮　敏　郑　欣　李成宇　郭开今

（徐州医学院附属医院骨科，徐州221000）

∙综述∙

兔骨缺损模型构建的研究进展*

芮敏郑欣李成宇郭开今**

（徐州医学院附属医院骨科，徐州221000）

骨缺损动物模型在骨组织工程技术研究中应用广泛。目前骨缺损动物模型常选择新西兰兔，建模方法主要有三种，分别为桡骨干、股骨干及股骨髁。三种建模方法各有优缺点，本文就兔骨缺损模型构建的研究进展进行综述。

骨缺损；动物模型；兔

【Key words】Bone defect；Animal model；Rabbit

由创伤、肿瘤等疾病引起的大段骨缺损，仍是现今骨科领域的挑战。自体骨移植被认为是治疗骨缺损的“金标准”，但其供量有限，术中取骨需额外手术，术后可能造成取骨部位慢性疼痛、骨折、神经损伤及切口感染等并发症，限制了其临床应用［1，2］；同种异体骨具有诱发免疫反应，与宿主骨整合、重塑缓慢，传播疾病等风险［2］。以多孔性生物相容的支架材料为基础的组织工程方法为骨缺损的临床治疗提供了一种有潜力的治疗途径［3］，为获得骨组织工程材料的特性，需要建立合适的骨缺损动物模型。

骨组织工程实验中，常用的大型动物有羊、犬、猪，小型动物有鼠、兔等。虽然鼠类实验成本较低，但体型较小，手术操作复杂，对实验者要求较高［4］；其次，作为小型啮齿动物，鼠类骨结构较原始，缺乏哈弗系统，其骨损伤后修复机制可能与人体修复机制不同［5］。而兔、犬、猪等动物具有与人体相似的骨骼哈弗系统，骨架大小合适，手术操作难度低，是比较理想的实验动物［5］。犬和猪实验成本较高，不适合推广应用，因而兔是比较常用的骨缺损模型动物［6］，本文就兔骨缺损模型的研究进展进行综述。

1　骨缺损部位及尺寸的选择

骨缺损愈合能力取决于多种因素：如缺损大小、缺损解剖部位，另外与动物年龄及营养状态也有一定关系［7］。实验中常用的兔骨缺损部位主要有桡骨干、股骨干及股骨髁等处，每一种模型中骨缺损大小及建模过程亦不相同。

1.1兔桡骨干模型

兔尺桡骨间有骨间膜相连接，能为缺损骨起代偿性作用；桡骨不是主要负重骨，桡骨制造骨缺损后不需要植入额外的内外固定，可避免术后负重及固定物对骨愈合环境的影响；另外，兔桡骨干骨缺损模型还具有手术操作简单、术中出血少等优势［8，9］。

合适的骨缺损大小，即临界性骨缺损（critical size defect，CSD）是动物模型的重要参数，它是指动物不能自行修复并愈合的最小骨缺损。CSD最先由Schmitz等描述，他们把CSD大小定义为其缺损骨干直径1.5～2.5倍长度［10］。而Cowan等［11］则认为CSD骨缺损大小至少应为其骨干直径的3～4倍。成年新西兰大白兔桡骨直径为5～6 mm，Bigham-Sadegh等［12］认为骨缺损大小应至少为骨干直径的2倍，将桡骨临界性骨缺损尺寸定为10～12 mm较合理，但既往研究中存在多种骨缺损大小［13-15］。Meimandi等［13］选取30只10～12月龄雄性新西兰兔随机分为三组，分别制作了剥离骨膜的10 mm桡骨干骨缺损模型，术后60 d取出标本行组织学观察，空白组中所有标本均未在缺损处发现桥接骨痂，断端存在纤维性连接，部分空腔被纤维软骨占据。三点弯曲试验显示其生物力学稳定性较正常骨组织差。赵明东等［14］应用40只新西兰兔桡骨分别设计10、12、14、17、20 mm骨缺损，术后12周取出标本，肉眼观察到10 mm组可见大部分骨缺损愈合，仅有1例标本呈骨不连状态。12 mm组中有5例标本缺损处仍有不完整骨痂，其中有纤维组织填充，其余标本缺损处有骨痂完全覆盖，而14、17、20 mm组标本可见缺损两端髓腔封闭。他们认为6月龄新西兰大白兔可选择14 mm及以上缺损长度制作桡骨骨缺损模型。类似的，李东亚等［15］在兔桡骨骨缺损实验中，对不同长度桡骨缺损做了分组对比：他们选取18只6月龄雄性新西兰兔，随机分为10、15、20 mm三组。术后12周肉眼可见10 mm组断端完全桥接且塑性良好，15 mm组仅有3例断端桥接，而20mm组断端未愈合；同时CT观察标本发现10 mm组髓腔再通，断端桥接，15 mm及20 mm组仅见少量骨再生，Hedberg评分显示：15 mm组修复能力与10 mm组有统计学差异，而与20 mm组无差异。基于上述结果，他们认为6月龄雄性新西兰兔制作桡骨CSD模型的长度选择15 mm较为合适。

1.2兔股骨干模型

虽然兔桡骨骨缺损模型具有不需内固定，操作简单等优点［8，9］，但该模型无法避免桡、尺骨间相互影响，桡骨骨缺损所产生的病理改变和生物力学变化可被另一骨的完整性部分代偿，同时还存在着成骨量少、与实际修复骨缺损环境差距较大等缺陷［16］。兔股骨为后肢单一负重骨，可以避免临近骨的代偿性作用对实验的影响；另一方面，临床上常见的骨缺损、骨不连常发生在股骨、肱骨等单一负重骨的骨干。可将兔股骨干骨缺损模型作为单一负重长骨缺损的动物模型。

Fialkov等［17］将12mm股骨干骨缺损定为其临界性缺损大小，他们在实验中将27只雌性新西兰兔随机分为三组，在术后2、4、6、8周通过X线分析显示空白组与实验组相比有统计学差异，术后8周空白组X线显示邻近接骨处存在新生骨吸收现象，同时组织学亦证实空白组断端未达到骨性连接。而Fan等［18］则选择15 mm兔股骨干临界性骨缺损，60只雄性成年新西兰兔随机分为3组，术后4、8、12周标本HE染色组织学结果显示空白组新生骨较少，定量分析显示新生骨百分比及成骨速度较实验组具有统计学差异；术后通过血CD34阳性表达量定量分析缺损骨周围血管再生情况发现空白组新生血管数较实验组少。王永刚等［19］选取18只4～5月龄成年新西兰兔，随机分为三组，分别制作10、15、20 mm长度的股骨干骨缺损，并以接骨板螺钉固定缺损两端。术后8、12周肉眼观察到10 mm组断端骨痂桥接，达到骨愈合，而15、20 mm骨缺损组断端处无连续骨痂通过，仍被纤维瘢痕组织填充。通过X线进一步证实10 mm骨缺损组第8、12周时骨缺损区有明显的新生骨痂影形成，而15、20 mm骨缺损组在各时间点缺损区均无成骨。最后组织学进一步证明12周时10 mm缺损组缺损区被大量新生骨和软骨组织填充，部分髓腔再通，近皮质处可见成熟的板层骨组织，而15、20 mm骨缺损组在12周缺损处仍由纤维结缔组织填充，无骨组织生成。他们认为经接骨板螺钉固定的15 mm兔股骨干模型可作为负重骨骨缺损模型。

虽然兔股骨干骨缺损模型具有自身的优势，但也同样存在不可避免的缺陷：兔股骨干骨缺损模型需要额外的固定，这些内固定装置占据骨缺损位置，且稳定性较差，可能会影响断端骨愈合，内固定物属于异物，长期存在于体内，增加了术后感染的风险，不方便术后管理，另外也会对植入物的实验作用产生干扰［20］。在手术操作中，由于内外固定物的应用，相对于其他类型骨缺损模型，术中对局部软组织及骨膜造成的损伤也相对较大。

1.3兔股骨髁模型

在兔骨缺损模型中，其长骨干骺端也常被用来研究骨修复和骨再生。兔股骨较上肢骨明显粗大，股骨髁突起明显，在体表可触及，便于术中解剖定位，手术操作时对周围组织损伤较小。另外，股骨作为后肢单一负重骨，可避免邻近骨的影响，股骨髁骨缺损模型还具有不需要额外固定等优势。参考众多兔股骨髁模型的文献［21-24］，一般都选择在股骨髁内侧或外侧使用小型电钻制作与股骨干轴线相对垂直的横向圆柱形缺损。

Betti等［21］利用成年新西兰兔制作直径6 mm，深8 mm股骨髁骨缺损模型，空白组术后30 d组织学观察发现：3例样本有结缔组织长入缺损空腔，缺损骨边缘有骨吸收现象，2例发现编织骨长入缺损处，同时有软骨骨痂形成。术后90 d编织骨被更成熟板状骨替代，至术后180 d有3例样本缺损处充满皮质骨。考虑兔的解剖学特征，有学者认为可进一步加深缺损深度，选择直径6 mm，深10 mm圆柱形骨缺损模型［22，23］。Gil-Albarova等［22］在实验中选用9月龄新西兰兔，设计左侧为实验组，右侧作为空白组。术后组织学观察：空白组没有发现明显新生骨，仅存在少量脂肪组织及血管。空白组在术后4个月X线仍能够清晰观察到缺损处存在孔隙，但孔隙随时间渐变小，与周围正常骨质相比，缺损处骨密度减低。他们认为这是由于缺损处骨表面仅部分愈合，没有被充分修复的结果。Liu等［24］报道了更大直径的股骨髁骨缺损模型（直径7 mm，深10 mm）：其在实验中将36只雄性大白兔随机分为三组，术后8周X线显示空白组未有新骨生成，至术后12周才发现断端周围有少量新生骨，但仍能观察到骨缺损空腔，另外术后12周Micro-CT结果也进一步证实空白组骨缺损未愈合。

2　兔龄的选择

现有文献报道中兔龄差距较大，有选择4月龄至12月龄不等［13，15，19，22，23］，Dong等［25］甚至选择了1～1.5年兔龄的新西兰兔。兔类在18～20周达到青春期，根据Rivas等对新西兰兔长骨及骨骺在不同生长阶段生长方式的研究，尽管16周龄兔长骨长度已经达到成年兔长骨长度的95%，但新西兰兔的骨骼生长在19～32周就已经停止［26］。在实验中，较多学者都倾向于选择6～9月龄雄性兔作为实验动物［15，22，23］。

Song等［27］在研究幼龄兔实验中，使用60只6周龄新西兰兔，在股骨干中段制作幼龄兔骨缺损模型，术后通过X线动态观察骨愈合情况，术后5～6周骨缺损区充满骨痂，术后7～9周即形成骨性连接。相反，王永刚等［19］在实验中使用4～5月龄成年新西兰大白兔作为实验动物制作股骨干缺损时，直到术后12周断端才形成骨痂桥接。一般认为，骨愈合是由一系列细胞及细胞因子参与的动态演变过程，其中骨形态发生蛋白（BMP）是影响骨愈合的重要生物因子，它能体内和体外诱导间质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞［28］。前述不同月龄兔骨修复时间不同可能与BMP分泌相关，Nagai等［29］在实验中证实：由BMP诱发的异位成骨速度及质量与年龄相关。

3　骨膜处理的选择

骨膜是微血管化的组织，覆盖在密质骨外表面，外层为纤维层，主要由胶原构成；内层为形成层，充当骨膜祖细胞的存储库，具有成骨潜力［30］。除了供给营养和氧气，它能为骨组织提供血供、刺激成骨细胞生长及生长因子释放等［31］。骨膜在骨缺损修复过程中能够产生软骨细胞、成骨细胞及骨细胞，其介导的骨修复机制可以简单概括为：在骨修复过程中发挥骨形成及软骨形成作用［31］。因而，移除或损伤骨膜可能阻碍骨骼的修复。

对于术中是否剥离骨膜存在一定争议，一般认为，为了能够明确评估移植物在缺损骨愈合中的作用，缺损处骨膜应彻底被清除［32］。Zhang等［33］认为在截断骨后，应至少向骨骺端剥离约5 mm长的骨膜，并使用生理盐水彻底清洗，以最大可能避免残余骨膜组织对实验的影响。Bodde等［34］认为，在兔桡骨模型中，除了清理缺损处残余骨膜外，相邻的桡尺骨骨间膜也应被刮除，以尽可能排除来自骨间膜的影响。他们在实验中发现骨缺损区两端的骨膜及尺桡骨骨间膜能够促进缺损断端形成骨性连接及骨性融合。Kang等［8］建议，在截骨旁尺骨表面放置一片透析膜，能够避免桡尺骨骨间膜对缺损骨的影响。

Song等［27］在研究骨膜在幼龄兔新西兰兔骨愈合的作用实验中，在股骨干中段制作骨缺损，根据是否保留骨膜及截骨长度分为不同组别，术后12周X线显示，去除骨膜组只有少量骨痂形成，未形成骨性连接，而保留骨膜组均能看到骨性连接。他们认为，当保存骨膜时，幼龄动物骨缺损处新骨能够形成，且骨愈合时间与骨缺损的量没有关系。詹玉林等［28］在研究骨膜对骨愈合影响实验中，选取48只4月龄新西兰兔随机分为切除骨膜组及保留骨膜组，制作桡骨中段0.5 cm骨缺损。术后肉眼观察显示：术后1周，两组表现基本相同，均未修复；但术后3、4周保留骨膜组形成坚硬骨痂样物质，断端连接坚固；切除骨膜组无骨痂形成。X线检测及Lane-Sandhu评分结果均显示：保留骨膜组骨愈合结果明显好于切除骨膜组，他们认为骨膜能够促进骨折愈合。但有学者认为剥离骨膜缺乏充足的证据，刮除骨表面的骨膜可能引起局部骨组织增生的生物反应，这种现象可能是骨膜形成层细胞刺激组织基质愈合而引起［35］。

综上所述，为了得到可靠的骨组织工程材料，选择合适的动物模型是实验设计中需要考虑的。在实验设计时，应密切结合临床，根据不同部位骨缺损的生物力学特性及相关的治疗方式，选择合适的骨缺损动物模型。这样，才能设计出更能符合实验需要的骨缺损模型，为临床骨缺损的治疗提供更为可靠的动物实验。

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Research progress of bone defect modeling in rabbits*

RUI min，ZHENG Xin，LI Chengyu，GUO Kaijin**
（Department of Orthopaedics，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xu Zhou 221000，China）

】As for bone tissue engineering research，bone defect animal model is widely applied.Recently，the New Zealand rabbit is always chosen as the experimental animal.Three defect sites（radius，femur and condyles of femur）have been used for experimentation.Buy there are their benefits and detractions of the three methods.Accordingly，we reviewed the research process of establishment of bone defect rabbit model in this paper.

2095-9958（2016）04-0176-05

10.3969/j.issn.2095-9958.2016.02-19

江苏省卫计委面上科研课题（课题编号：H201528），江苏省级重点研发专项资金项目（项目编号：BE2015627），江苏省卫生厅科技项目（项目编号：Q201201）

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郭开今，E-mail：xzgkj@sina.com