人鼻病毒感染研究进展

奚志敏　沈军　王立波



·综述·

人鼻病毒感染研究进展

奚志敏沈军王立波

201102 上海市复旦大学附属儿科医院呼吸科(奚志敏、王立波)，感染科(沈军)

【摘要】人鼻病毒(Human Rhinovirus，HRV)是引起人类呼吸道感染的最常见病原体之一，通常表现为较轻且具自限性的上呼吸道感冒症状，也可以感染下呼吸道引起肺炎、儿童喘息、哮喘加重以及成人慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。自1956年人类分离到第一株HRV后，目前已有150多种血清型，HRV被认为是人类急性上呼吸道感染的最常见病原。近几年随着分子生物学技术的广泛应用，HRV研究发展迅速，尤其C型的发现，并发现HRV与人类急性下呼吸道感染也密切相关。

1分子生物学特征

1.1病毒结构与基因组成HRV属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus，EV)，是单股正链RNA，编码7200个核苷酸。基因组结构中唯一阅读框转录翻译11个蛋白片段。病毒衣壳由结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4组成，VP1、VP2、VP3是与细胞受体相结合的场所，VP1是病毒逃避宿主免疫反应、中和抗体和连接分子受体的重要部分，也是抗病毒物质的结合位点，是产生保护性抗体的主要抗原。

1.2血清分型与基因分型根据对VP4/VP2衣壳蛋白编码区基因序列的系统进化分析，传统鼻病毒有HRV-A(74种血清型)和HRV-B(25种血清型)两型，现已完成这99种血清型的全基因序列测定[1]。Lamson D等应用Mass Tag PCR技术发现另一种新型病毒簇：HRV-C，近几年相继又有60多种HRV亚型被发现，大部分被确定为HRV-C型，部分被建议归为可能存在的HRV-D型[2,3]。HRV-C型的血清型分型尚未能确定。核苷酸序列水平方面，VP4/VP2编码区是区分HRV各基因型的基础，VP1编码区利于区分HRV各基因型亚型，易于发现新型HRV的可能，HRV-A、HRV-B和HRV-C各型在VP4/VP2编码区的差异性分别为10%、9.5%、10%，在VP1编码区的差异性分别为13%、12%、13%[4]。最新发现的HRV-C在亚基因型分型的判断依据上，目前主流的观点是以VP4/VP2基因区核苷酸差异性>10%将目前发现的HRV-C分为28种亚型，而Simmonds和McIntyre等学者建议依据HRV-C中VP1核苷酸序列差异性>13%为一标准，将发现的HRV-C分成33种亚型[2.5]。

1.3病毒复制有三种细胞表面受体参与HRV与细胞的结合：细胞间黏附分子1(ICAM-1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)以及HRV-87利用的受体(衰减-加速因子)[6]，其中超过90%HRV利用ICAM-1侵入细胞。根据受体类型不同，HRV依赖或非依赖网格蛋白，行胞吞或胞饮作用侵入细胞，随之异构成疏水性亚病毒颗粒。这一过程需要ICAM-1或低PH环境。RNA基因借助病毒蛋白或细胞膜破水的微孔，穿透亚病毒颗粒膜进入胞质，接着宿主细胞核糖体转录RNA成多聚蛋白，最终复制成RNA病毒。目前HRV-C的特定细胞受体和病原学机制尚不明确。

1.4传播途径HRV主要通过直接接触或污染物间接接触传播，多为自体接种，少部分通过吸入悬浮颗粒物传播。HRV在鼻分泌物内存活5至7 d，鼻咽部可延长至2到3周。最大传染期在疾病最初5 d内，当接种到鼻腔内或结膜表面时，即定植于鼻黏膜并致病，口腔内接种无效，提示口腔内上皮细胞可能不表达HRV特异性细胞受体。

2发病机制的研究

呼吸道上皮细胞是HRV感染的靶细胞，与呼吸道上皮细胞的特异性受体(ICAM-1和LDLR)结合并复制，引起炎症反应。HRV受体作用部位位于距表面20埃深的低陷处，又称为“canyon”，大多数以canyon区与上皮细胞表面的ICAM-1结合，以脱壳机制感染细胞；小部分通过LDLR进行细胞联接[7]。脱壳机制包括如下过程：HRV与ICAM-1连接形成复合物处于可逆状态；通过开放5次折叠顶部的孔道，穿越外侧病毒蛋白4和病毒蛋白1的N端，受体移位粘附病毒及病毒表面结构改变，最终RNA脱壳而出[8]。

由于大部分HRV最适于33 ℃～34 ℃生长与复制，在37 ℃复制能力下降，普遍的观点是HRV不能感染下呼吸道上皮细胞。但近期研究者发现，HRV-C15和HRV-C41在34 ℃和37 ℃生长水平相同，并提示HRV-C更易引起婴幼儿下呼吸道感染和儿童哮喘[7]。有研究发现，HRV感染不仅是诱发急性哮喘发作常见病因之一，而且是引起婴儿和幼儿喘息性疾病的常见病因，并且发现儿童早期HRV感染诱发的反复喘息发作将来发展成哮喘的风险明显升高[9,10]。HRV通过损伤呼吸道上皮细胞间接或直接感染下呼吸道，机制包括病毒调节呼吸道上皮和炎性细胞释放炎性细胞因子和炎性介质，调节呼吸道微血管内皮细胞导致呼吸道壁水肿；调节HASM细胞功能；通过Toll样受体(TLR)介导促进细胞外基质(ECM)蛋白沉积，诱导呼吸道重塑[11]；增强副交感传出神经元活动，促进呼吸道感觉神经C类纤维释放支气管活性神经肽，调节呼吸道非肾上腺素能/非胆碱能神经系统的作用[12]。

3流行病学及临床特征

HRV在全世界范围内均有感染，全年均可发病，其流行随地区有所不同，但有明显季节分布，高峰在春季和秋季[13]。很多流行病学研究指出，HRV-C仅次于HRV-A，感染率为30%～50%，且常与其它类型病毒混合存在(RSV病毒最常见)[14]。研究显示HRV-A和HRV-C是住院儿童和成人急性呼吸道疾病的主要类型[15,16]。目前研究表明，HRV-C主要在秋季流行，HRV-A主要在春季流行[4,17]。

HRV感染涉及各个年龄组，<3岁年龄儿童更易引起严重下呼吸道感染[18]。HRV感染引起的免疫反应在不同性别中无明显差别[19]，部分HRV感染无临床症状，症状性感染主要为普通感冒及流感样表现，包括流涕、鼻塞、喷嚏、头痛、轻度喉咙痛、咳嗽、有或无发热，平均病程7 d，并发症包括急性中耳炎、鼻窦炎等。通过原位杂交和逆转录PCR(RT-PCR)检测鼻病毒RNA在婴幼儿下呼吸道感染可达11.4%，在HRV相关的哮喘恶化中则达25%[20]。有研究对肺泡灌洗液等下呼吸道标本的检测，更支持了HRV对下呼吸道疾病的重要作用[21-23]。相对于HRV-A和HRV-C，HRV-B的检出率较低。相对于成人，儿童具有更高的HRV-A与HRV-C感染率，特别是儿童HRV-C的感染率显著高于成人，与儿童下呼吸道感染密切相关[24]。HRV感染尤其是HRV-C感染是哮喘加重的主要原因。有研究者对287例急性喘息、哮喘稳定期、非哮喘患者的对比研究显示，急性喘息组的HRV检出率达64%，其中HRV-C占75%，且IgE滴度显著增高，而另两种HRV检出率均为13%[25]。

4检测方法

4.1抗原检测和血清学试验由于HRV亚型众多、缺乏常见的群抗原，故HRV抗原检测困难，同时使抗体检测在临床诊断中缺乏意义。血清抗体常在HRV感染后1至3周可检测到，IgA主要出现在鼻腔分泌物中，IgG主要出现在血清中，因此常用作回顾性流行病学研究。

4.2病毒分离培养病毒分离培养有助于研究HRV生物学特征及发病机制。临床实验常规用人胚胎肺纤维细胞、HeLa细胞或肾母细胞培养，但其耗时长、不能连续分离出高产量的HRV。组织培养常规采用胎儿鼻腔或气管上皮细胞，已有研究采用鼻窦细胞生长分离出HRV-C[26]。

4.3分子学方法HRV检测应用较广泛的方法是逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，其目的基因多为HRV和肠道病毒(EV)高度保守的5′UTR，并进一步通过扩增子大小、限制性酶切、HRV特异性探针杂交、RT-PCR后测序和实时RT-PCR把HRV从肠道病毒属分离出来。这些方法繁琐，技术要求和费用均较高。Do等[27]选用特异性HRV通用引物序列，建立了快速、敏感、特异的一步法RT-PCR方法用于HRV检测。实时荧光定量RT-PCR的方法灵敏度、特异度、重复性均较好[28]，该方法研究提示鼻病毒载量与疾病症状具相关性[29]。近几年随着大量针对不同呼吸道病毒的多重PCR探测方法的应用，使HRV检测趋于更简化、更高效，临床上更多严重疾病被发现与HRV相关，尤其是发现了传统培养分离困难的诸多新型HRV-C病毒株[30,31]。

5基因突变与基因重组

基因突变、基因重组及选择压力是促进HRV进化的动力，使HRV具高遗传变异性[32]。RNA聚合酶不具有校正功能，在每个循环复制过程中存在103～104核苷酸错误率，这为HRV的进化提供了无尽可能。Cordey等[33]发现基因突变存在于HRV的整个开放性阅读框中，VP2、VP3、VP1、2C和3C存在较高突变率，而VP4、2A、2B、3A、3B和3D区域相对保守。Tapparel等[34]发现非同义突变绝大部分存在于VP1、VP2、VP3区，提示HRV表面衣壳蛋白在承受机体免疫压力的同时，其高突变性为HRV逃避宿主免疫系统攻击、适应呼吸道环境及长期稳定流行提供可能性。

深入研究[7,34,35]发现，HRV种属内部以及与肠道病毒之间存在大量基因重组。推测原因可能是多种病毒共感染同一个体，HRV与肠道病毒均属于小RNA病毒，核酸水平存在一定相似性，故在复制过程中产生重组。HRV基因的重组可以随机地发生在整个编码区，其中非编码区和非结构区是主要区域[1,35]。Huang等[36]和McIntype等[5]发现，HRV-C与HRV-A发生重组的两个精确位点在5′UTR的第5个茎杆区、多嘧啶区和编码2A的基因内。其中Huang等[36]对HRV 的5′UTR分析发现，部分HRV-C的5′UTR含有长度不一的属于HRV-A的5′UTR基因片段，推测可能由HRV-A的同一区域重组而来，首次将HRV-C分为两个亚种：HRV-Ca和HRV-Cc。Palmenberg等[1]提出HRV-A可能发生了种内重组，产生一个新的HRV进化支：HRV-D。系统发生学证据和测序分析表明HRV-D很可能是HRV的最新基因型。Lewis-Rogers等[37]发现HRV-A和HRV-B与肠道病毒科其他成员存在重组现象，但目前尚没有报道发现HRV与肠道病毒科以外的其他病毒存在重组现象。

6防治

HRV感染药物目前的研究方向主要集中在作用于病毒的吸附、脱壳、核酸复制及蛋白合成等几个过程[38]，如可溶性细胞粘附因子曲马拉奇(tremacamra)，衣壳蛋白抑制剂普拉康纳利(Pleconaril)、吡罗达韦(pirdavir)，病毒RNA复制抑制剂恩韦肟(enviroxine)，3C蛋白酶抑制剂芦平曲韦(rupintrivir)等，相关研究仍在进行。由于HRV存在多种血清型，疫苗研发困难，希望通过对HRV全基因的测序，设计出新一代具有良好抗病毒活性的疫苗。

7展望

目前HRV导致的急性呼吸道感染已得到广泛关注和研究，但仍面临诸多问题和挑战。借助飞速发展的生物学技术，在进一步研究HRV基因突变与重组带来的病毒感染能力及毒力的变化、基因分析和血清学分型、HRV感染人体的致病机制、疫苗研制等方面会有不断突破。HRV高遗传变异性对于公共卫生安全是一个巨大疾病负担和不可忽视的潜在问题，对HRV的深度研究与监测非常重要。

4参考文献

[1]Palmenberg AC, Spiro D, Kuzmickas R, et al. Sequencing and analyses of all known human rhinovirus genomes reveal structure and evolution[J]. Science, 2009,324(5923):55-59. doi: 10.1126/science.1165557.

[2]Simmonds P, McIntyre C, Savolainen-Kopra C, et al. Proposals for the classification of human rhinovirus species C into genotypically assigned types[J]. J Gen Virol, 2010,91(Pt 10):2409-2419. doi: 10.1099/vir.0.023994-0.

[3]Jartti T, Jartti L, Ruuskanen O, et al. New respiratory viral infections[J]. Curr Opin Pulm Med, 2012,18(3):271-278. doi: 10.1097/MCP.0b013e328351f8d4.

[4]McIntyre CL, Knowles NJ, Simmonds P. Proposals for the classification of human rhinovirus species A, B and C into genotypically assigned types[J]. J Gen Virol, 2013,94(Pt 8):1791-1806. doi: 10.1099/vir.0.053686-0.

[5]McIntyre CL, McWilliam LEC, Savolainen-Kopra C, et al. Analysis of genetic diversity and sites of recombination in human rhinovirus species C[J]. J Virol, 2010,84(19):10297-10310. doi: 10.1128/JVI.00962-10.

[6]Blomqvist S, Savolainen C, Råman L, et al. Human rhinovirus 87 and enterovirus 68 represent a unique serotype with rhinovirus and enterovirus features[J]. J Clin Microbiol, 2002,40(11):4218-4223.

[7]Ashraf S, Brockman-Schneider R, Bochkov YA, et al. Biological characteristics and propagation of human rhinovirus-C in differentiated sinus epithelial cells[J]. Virology, 2013,436(1):143-149. doi: 10.1016/j.virol.2012.11.002.

[8]Chung Y, Hong JY, Lei J, et al. Rhinovirus infection induces interleukin-13 production from CD11b-positive, M2-polarized exudative macrophages[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2015,52(2):205-216. doi: 10.1165/rcmb.2014-0068OC.

[9]Leigh R, Proud D. Virus-induced modulation of lower airway diseases: pathogenesis and pharmacologic approaches to treatment[J]. Pharmacol Ther, 2015,148:185-198. doi: 10.1016/j.pharmthera.2014.12.005.

[10]Jamieson KC, Warner SM, Leigh R, et al. Rhinovirus in the Pathogenesis and Clinical Course of Asthma[J]. Chest, 2015,148(6):1508-1516. doi: 10.1378/chest.15-1335.

[11]Kuo C, Lim S, King NJ, et al. Rhinovirus infection induces expression of airway remodelling factors in vitro and in vivo[J]. Respirology, 2011,16(2):367-377. doi: 10.1111/j.1440-1843.2010.01918.x.

[12]Hammond C, Kurten M, Kennedy JL. Rhinovirus and asthma: a storied history of incompatibility[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2015,15(2):502. doi: 10.1007/s11882-014-0502-0.

[13]Ouédraogo S, Traoré B, Nene BZA, et al. Viral etiology of respiratory tract infections in children at the pediatric hospital in Ouagadougou (Burkina Faso)[J]. PLoS One, 2014,9(10):e110435. doi: 10.1371/journal.pone.0110435.

[14]Fuji N, Suzuki A, Lupisan S, et al. Detection of human rhinovirus C viral genome in blood among children with severe respiratory infections in the Philippines[J]. PLoS One, 2011,6(11):e27247. doi: 10.1371/journal.pone.0027247.

[15]Calvo C, Casas I, García-García ML, et al. Role of rhinovirus C respiratory infections in sick and healthy children in Spain[J]. Pediatr Infect Dis J, 2010,29(8):717-720. doi: 10.1097/INF.0b013e3181d7a708.

[16]Smuts HE, Workman LJ, Zar HJ. Human rhinovirus infection in young African children with acute wheezing[J]. BMC Infect Dis, 2011,11:65. doi: 10.1186/1471-2334-11-65.

[17]Onyango CO, Welch SR, Munywoki PK, et al. Molecular epidemiology of human rhinovirus infections in Kilifi, coastal Kenya[J]. J Med Virol, 2012,84(5):823-831. doi: 10.1002/jmv.23251.

[18]Daleno C, Piralla A, Scala A, et al. Phylogenetic analysis of human rhinovirus isolates collected from otherwise healthy children with community-acquired pneumonia during five successive years[J]. PLoS One, 2013,8(11):e80614. doi: 10.1371/journal.pone.0080614.

[19]Carroll ML, Yerkovich ST, Pritchard AL, et al. Adaptive immunity to rhinoviruses: sex and age matter[J]. Respir Res, 2010,11(1):184. doi: 10.1186/1465-9921-11-184.

[20] álvaro M, Giner MT, Vázquez M, et al. Reply to correspondence letter by M. Korppi[J]. Eur J Pediatr, 2013,172(2):283-284. doi: 10.1007/s00431-012-1877-3.

[21]谢乐云, 钟礼立, 张兵, 等. 122例重症肺炎患儿支气管肺泡灌洗液的病毒检测分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2013,27(2):95-97. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2013.02.005.

[22]Drieghe S, Ryckaert I, Beuselinck K, et al. Epidemiology of respiratory viruses in bronchoalveolar lavage samples in a tertiary hospital[J]. J Clin Virol, 2014,59(3):208-211. doi: 10.1016/j.jcv.2013.12.008.

[23]Cox DW, Le SPN. Rhinovirus and the developing lung[J]. Paediatr Respir Rev, 2014,15(3):268-274. doi: 10.1016/j.prrv.2014.03.002.

[24]Chen WJ, Arnold JC, Fairchok MP, et al. Epidemiologic, clinical, and virologic characteristics of human rhinovirus infection among otherwise healthy children and adults: rhinovirus among adults and children[J]. J Clin Virol, 2015,64:74-82. doi: 10.1016/j.jcv.2015.01.007.

[25]Ren L, Xiang Z, Guo L, et al. Viral infections of the lower respiratory tract[J]. Curr Infect Dis Rep, 2012,14(3):284-291. doi: 10.1007/s11908-012-0258-4.

[26]Bochkov YA, Palmenberg AC, Lee WM, et al. Molecular modeling, organ culture and reverse genetics for a newly identified human rhinovirus C. Nat Med, 17: 627- 632. doi: 10.1038/nm.2358.

[27]Do DH, Laus S, Leber A, et al. A one-step, real-time PCR assay for rapid detection of rhinovirus[J]. J Mol Diagn, 2010,12(1):102-108. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090071.

[28]周英杰, 孙亚萍, 曹海燕, 等. 鼻病毒逆转录实时荧光定量PCR方法的建立及应用. 中华实验和临床病毒学杂志, 2014, 28(2): 129-131. doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2014.02.018.[29]Utokaparch S, Marchant D, Gosselink JV, et al. The relationship between respiratory viral loads and diagnosis in children presenting to a pediatric hospital emergency department. Pediatr Infect Dis J, 2011, 30(2): e18-23. doi: 10.1097/INF.0b013e3181ff2fac.

[30]Bochkov YA, Grindle K, Vang F, et al. Improved molecular typing assay for rhinovirus species A, B, and C. J Clin Microbiol, 2014, 52(7): 2461-2471. doi: 10.1128/JCM.00075-14.

[31]Fawkner-Corbett DW, Khoo SK, Duarte CM, et al. Rhinovirus-C detection in children presenting with acute respiratory infection to hospital in Brazil. J Med Virol, 2016, 88(1): 58-63. doi: 10.1002/jmv.24300.

[32]Waman VP, Kolekar PS, Kale MM, et al. Population structure and evolution of Rhinoviruses[J]. PLoS One, 2014,9(2):e88981. doi: 10.1371/journal.pone.0088981.

[33]Cordey S, Junier T, Gerlach D, et al. Rhinovirus genome evolution during experimental human infection[J]. PLoS One, 2010,5(5):e10588. doi: 10.1371/journal.pone.0010588.

[34]Tapparel C, Cordey S, Junier T, et al. Rhinovirus genome variation during chronic upper and lower respiratory tract infections[J]. PLoS One, 2011,6(6):e21163. doi: 10.1371/journal.pone.0021163.

[35]Schibler M, Gerlach D, Martinez Y, et al. Experimental human rhinovirus and enterovirus interspecies recombination[J]. J Gen Virol, 2012,93(Pt 1):93-101. doi: 10.1099/vir.0.035808-0.

[36]Huang T, Wang W, Bessaud M, et al. Evidence of recombination and genetic diversity in human rhinoviruses in children with acute respiratory infection[J]. PLoS One, 2009,4(7):e6355. doi: 10.1371/journal.pone.0006355.

[37]Lewis-Rogers N, Bendall ML, Crandall KA. Phylogenetic relationships and molecular adaptation dynamics of human rhinoviruses[J]. Mol Biol Evol, 2009,26(5):969-981. doi: 10.1093/molbev/msp009.

[38]Jacobs SE, Lamson DM, St George K, et al. Human Rhinoviruses. Clin Microbiol Rev, 2013, 26(1):135-162. doi: 10.1128/CMR.00077-12.

通信作者：王立波，Email：wanglbc@163.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.019

(收稿日期：2016-01-07)

Progress in research of human rhinovirus infections

Xizhimin,ShenJun,WangLibo

PediatricHospitalaffiliatedFudanUniversityofShanhai,201102,ChinaCorrespondingauthor:WangLibo,Email：wanglbc@163.com

【Abstract】Human Rhinovirus (HRV) is one of the most frequent cause of the human respiratory tract infection. HRV is traditionally associated with the benign common cold and it has now been demonstrated as a respiratory pathogen in lower respiratory tract diseases, such as pneumonia, children’s wheezy disease, asthma exacerbation and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) etc. Since the first HRV was discovered in 1956, now more than 150 serotypes were confirmed. HRV is considered the most common cause of upper respiratory tract infection. Nearly years-round advances in molecular methods have enhanced our understanding of the genomic structure of HRV, especially the newly discovered HRV-C, and it has been found that HRV is closely related to human acute lower respiratory infections.