甘肃地区“平凉45号”冬小麦NRX基因的克隆及表达分析

朱占东， 刘学锋，柴守玺*　(.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070；.新疆生产兵团第十四师一牧场，新疆和田 848306)



甘肃地区“平凉45号”冬小麦NRX基因的克隆及表达分析

朱占东1， 刘学锋2，柴守玺1*(1.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070；2.新疆生产兵团第十四师一牧场，新疆和田 848306)

硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)作为一类多功能蛋白广泛存在于植物各种组织器官中，在植物光合作用过程中起重要作用，参与该过程中体内活性氧的清除、被氧化蛋白质的修复、电子传递等活动[1-4]。同时，TRX基因参与植物抗氧化胁迫过程、抗旱以及耐热机制的调控，同时还参与调节抗逆基因的表达[5]。Laughner等[6]首次从玉米植株中分离得到核氧还蛋白(nucleoredoxin, NRX)，结果发现该基因编码蛋白为TRX家族新成员，而且该蛋白三级结构包含3个TRX活性功能区；夏德习等[7]研究表明，利用H2O2处理拟南芥后，硫氧还蛋白中的M1型基因((AtTRXm1)表达量明显上升，说明该蛋白与氧化胁迫过程有关。另外，Broin等[8]研究发现，CDSP32蛋白属于干旱诱导蛋白，二级结构存在与 TRX蛋白类似的2个肽序列。因此该蛋白属于TRX超家族成员，研究表明该蛋白可以缓解由于干旱而引起的氧化胁迫。目前关于TRX超家族基因所参与的代谢途径和功能表达机理尚不清楚，而且在其他植物种类中也未见该基因的相关报道。

2004年甘肃地区小麦播种面积接近130 万hm2[9]，其中陇东地区冬小麦的播种面积和总产值分别占全省的53%和48%[10]。甘肃地区地形复杂，常年雨水量偏少、干旱是影响甘肃地区小麦生产的重要因素[11]，严重威胁着该地区小麦生产。

笔者以甘肃地区优良杂交种“平凉45号”冬小麦为材料，对TRX家族成员进行克隆，并利用生物信息学手段，分析其相关的结构信息，以期为选育优良的小麦品种提供依据，以保障该区域粮食生产的持续稳定发展和满足人民生活的供给需求。

1材料与方法

1.1材料“平凉45号”冬小麦种子购买于甘肃省平凉市农牧局，通风干燥条件室温保存。

EasyTaqPCR SuperMix、dNTPs、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pMD19-T克隆载体、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、DNA marker购自全式金生物技术有限公司(北京)；大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株由甘肃农业大学干旱作物重点实验室保存，大肠杆菌感受态细胞为甘肃农业大学干旱作物重点实验室制备。

1.2方法

1.2.1总RNA提取和cDNA的合成。 将“平凉45号”冬小麦的种子经除菌处理后，接种在铺有MS培养基的三角瓶内，放入光照培养箱中，20 ℃暗培养至苗高15 cm左右，300 μmol/(m2·s)光照培养2 d，采集叶片用Trizol试剂盒(购自TaKaRa公司)提取总RNA，每个样品采集3个重复。

取小麦叶片，放在含有液氮的研钵中并迅速研磨至粉末状，然后转移到1.5 ml EP管中并立即加入1 ml TRIzol提取总RNA，操作步骤按TRIzol试剂盒说明书进行，然后将RNA保存于超低温冰箱。取小麦总RNA 4 μl通过反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA。20 μl反应体系：4 μl 总RNA，TransScript* RT/RI Enzyme Mix 1 μl，2×TS Reaction Mix 10 μl，Anchored Oligo(dT)18 1 μl，然后用无RNA酶水补齐20 μl。该体系反应条件按照说明书进行。

1.2.2PCR扩增。检索相关文献，得到普通小麦TaNRX基因的信息。搜索NCBI得到该基因的核酸序列与蛋白序列信息，根据核酸序列设计引物，结合Primer 3软件(http://frodo.wi.mit.edu/)，设计引物序列(表1)。

表1　TaNRX家族基因引物序列

以“平凉45号”冬小麦叶片材料反转录cDNA为模板，20 μl反应体系：小麦cDNA1 μl， EsTaqMix 10 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl， 双蒸水8 μl；在MG96+型PCR仪上进行PCR反应。其反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；然后对扩增产物进行检测。

1.2.3目的片段回收及克隆。采用EasyPure Quick Gel Extraction Kit(购自全式金)纯化回收目的条带，按照3∶1比例与pMD19-T Vector载体混合，4 ℃孵育过夜；然后利用感受态细胞将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中进行培养，随机选取12个大小适中的白色菌落进行鉴定并测序。

1.2.4生物信息学分析。通过Clustalx软件比对分析测序后的核酸序列，同时作进化树分析。通过ProtParam软件在线分析NRX基因编码蛋白质的理化性质；通过TMHMM Server V.2.0在线预测NRX基因的跨膜结构；通过SignalP 3.0 Server 软件预测编码蛋白质的信号肽序列；同时，通过SOPMA软件对NRX基因编码蛋白的二级结构进行预测。

1.2.5NRX基因定量表达检测。取“平凉45号”冬小麦不同器官，每个器官设置3个重复。分别提取RNA，反转录合成cDNA，用荧光定量PCR试剂盒进行不同器官的定量检测。通过FL-3000 Realtime PCR 系统，以小麦延伸因子EF1( elongation factors 1)基因为内参基因[12]，每个样品使用3个重复，最后通过2-ΔΔCt法[13]计算基因相对表达。

2结果与分析

2.1小麦总RNA提取以及反转录将新鲜样品用液氮研磨，随后用TRIzol提取RNA，经微量紫外分光光度计测定OD260/OD280为1.92，浓度为753 ng/μl。取4 μl RNA样品进行反转录，合成cDNA。用延伸因子EF1(elongation factors 1)引物进行PCR，电泳检测条带清晰，大小合适，证明成功得到小麦cDNA。

2.2Trx家族基因NRX的PCR扩增及克隆以“平凉45号”小麦叶片cDNA为模板，PCR产物大小在1 500～2 000 bp，与Genbank中搜索的晋麦47号TaNRX大小相近(图1)。PCR产物经琼脂糖凝胶回收后与pMD19-T Vector连接，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆进行测序。

2.3生物信息学分析

2.3.1NRX基因核苷酸序列分析将测序(大连宝生物生物工程有限公司)得到的核酸序列，用ExPASy、EMBL-EBI和DNAMAN软件进行比对。结果表明克隆得到的目的片段包含起始密码子ATG和终止密码子TAG，有完整的ORF开放阅读框，大小为1 734 bp，编码577个氨基酸，具有高度保守的氧化还原活性结构区(redox active motif)：WCPPC和WCGPC，属于TRX家族(图2)。通过多重比对与聚类分析(图3、4)发现，NRX基因的核苷酸序列与大麦同源性为88%，与水稻的同源性为82%，与Genbank中晋麦47的TaNRX-a基因的核酸序列完全相同，表明成功克隆至“平凉45号”小麦的NRX基因。

2.3.2NRX编码蛋白一级结构和理化性质。通过ProtParam在线预测NRX基因的理化性质等。生物信息学显示，NRX基因编码的蛋白分子式为 C5103H08474N1734O2132S400，分子量为14.11 kD，等电点4.95,不稳定系数43.18，通常，蛋白的不稳定系数在40以下为稳定蛋白，因此，“平凉45号”冬小麦NRX基因编码不稳定蛋白；氨基酸以Gly(28.6%)、Ala (25.4%)、Cys(23.1%)、Thr(22.9%)为主；脂肪系数为25.43，疏水性平均数为0.760，预测NRX基因编码脂溶性蛋白。

2.3.3氨基酸信号肽预测。通过SignalP 3.0 Server在线预测NRX基因编码序列信号肽。当C、Y及S的平均值在0.5以上，同时3个值的结果均为“YES”时，氨基酸序列中才有可能存在信号肽。该基因的S平均值为0.89，C与Y平均值都小于0.5，且三值获得的结果都是“NO”，预测NRX基因编码的蛋白没有信号肽。

2.3.4跨膜结构预测。利用TMHMM Server V.2.0对NRX基因编码蛋白进行跨膜区段预测。结果显示，NRX基因编码的蛋白肽链都不在细胞生物膜上，无明显跨膜区域。最后分析获得该基因的功能区不在生物膜上。

2.3.5蛋白二级结构分析。通过SOPMA软件对NRX基因编码的氨基酸二级结构进行分析(表2，图5)，结果表明，该蛋白由 α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、延伸链构成，其中α-螺旋所占的比例最大，为34.32%，结合氨基酸预测结果，表明“平凉45号”冬小麦NRX基因编码的蛋白不稳定。

表2　蛋白二级结构预测

2.4基因器官表达分析通过实时荧光定量PCR进行基因表达分析，以小麦EF1作为表达对照基因，检测目的基因在“平凉45号”杂交冬小麦4种器官中的表达情况。结果显示，NRX基因在其根、茎、茎尖、叶中均有表达，其中根和茎中相对表达量较高，而在叶中的相对表达量偏低(图6)。

3结论与讨论

植物抗旱是多个基因表达及其环境因素共同作用的结果。核氧还蛋白(NRX)最早是Kurooka等[14]在酵母中发现的，因为含有二硫化物活性中心CGPC(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)区而被认定为TRX 超家族成员。 植物的NRX最早在玉米中被发现[15]，TRX家族成员具有改变植物自交不亲和性状的功能，可以用于改良作物的基因型，近2年在大麦、小花棘豆、甘蓝、铁皮石斛、甘蔗等植物中研究较多。通过抗逆基因的表达调控进而研究抗旱、耐热、抗氧化胁迫的机制，将有助于改良作物的遗传性状[8]。该研究利用杂交种“平凉45号”小麦抗旱性较强的特点，从其基因组中克隆出NRX基因，其开放阅读框为1 734 bp，编码577个氨基酸，包含2个氧化还原二硫化物活性中心WCGPC和WCPPC。生物信息学分析表明，“平凉45号”冬小麦中该基因编码不稳定、脂溶性蛋白，且无信号肽及跨膜结构区域，编码的蛋白质为非分泌蛋白，这与晋麦47号小麦有差异，可能与品种和取材有关。NRX基因生物信息学分析为进一步研究该基因调控方式提供了基础。

通常，TRX分为家族Ⅰ和家族Ⅱ，TRX家族Ⅰ中m、f、h类广泛存在于高等植物不同器官上。如m和f存在于叶绿体，而h存在细胞质内[16]。小麦TaNRX基因与抗旱相关的等位变异包括TaNRX-a和TaNRX-b基因型[17-18]。研究表明，TRX在模式植物拟南芥、烟草、小麦胚芽、杨树及番茄、大麦种子、马铃薯根茎、水稻韧皮部、菠菜叶片中均有不同分布[19-20]。经过分析，其结构与在晋麦47号中发现的TaNRX-a型特征序列相似[12]。

对“平凉45号”冬小麦4种器官NRX基因表达水平进行检测，结果表明，NRX基因在小麦4种器官上均表达，但NRX基因在小麦不同器官的表达量具有较大差异，体现出不同器官NRX基因不同的表达模式，表明在不同器官中NRX基因的调控方式和机制存在差异。因此，对NRX基因的功能研究需要对不同器官或同一器官不同发育时期分别进行对比研究。

该研究对NRX基因的研究结果为下一步更深层次地研究NRX基因的功能作用及调控机理提供依据，为甘肃地区抗旱小麦的研究提供参考，具有十分重要的实践意义。

参考文献

[1] ARNÉR E S J, HOLMGREN A. Physiological functions of thioredoxinand thioredoxin reductase[J]. Eur J Biochem, 2001, 267: 6102-6109.

[2] WONG J H, BALMER Y, CAI N, et al.Unraveling thioredoxin-linked metabolicprocesses of cereal starchy endosperm using proteomics[J]. FEBS Lett, 2003,547:151-156.

[3] MEYER Y, VIGNOLS F, REICHHELD J P. Classification of plant thiore-doxins by sequence similarity and intron position[J]. Methods Enzymol, 2002,347:394-402.

[4] 张帆,蒋雷,鞠丽萍，等.一个普通小麦 Trx 超家族新基因TaNRX的克隆与抗旱相关标记开发[J].作物学报,2014,40(1):29-36.

[5] 郑琼,马旭俊,杨传平.硫氧还蛋白(Trx)的研究进展[J].分子植物育种, 2006,4(S2):78-82.

[6] LAUGHNER B J, SEHNKE P C, FERL R J. A novel nuclear member ofthe thioredoxin superfamily[J]. Plant Physiol,1998,118:987-996.

[7] 夏德习,管清杰,金淑梅,等.拟南芥硫氧还蛋白 M1 型基因(AtTRX m1)与环境逆境之间的关系[J].分子植物育种,2007(5):21-26.

[8] BROIN M, REY P. Potato plants lacking the CDSP32 plastidic thio-redoxin exhibit overoxidation of the BAS1 2-cysteine peroxire-doxin and increased lipid peroxidation in thylakoids underphotooxidative stress[J]. Plant Physiol,2003,132:1335-1343.

[9] 魏邦龙,白天志,包世堂.甘肃小麦栽培模拟优化决策系统的研制[J].西北师范大学学报,2004,40(2):86-89.

[10] 任根深,王伟.冬小麦新品种平凉45号选育报告[J].甘肃农业科技,2010(5):3-5.

[11] ZHENG W J, XU Z S, CHEN M,et al.Isolationand characterization of receptor-like protein kinase WELP1 inwheat[J]. Afr J Microbiol Res,2012,6:2410-2418.

[12] 黄雪玲,冯浩,康振生.小麦条锈菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择[J].农业生物技术学报,2012,20(2):181-187.

[13] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCRa nd the 2-ΔΔCtmethod[J].Methods,2001,25:402-408.

[14] KUROOKA H, KATO K, MINOGUCHI S,et al.Cloning and characterization of the nucleoredoxin gene that en-codes a novel nuclear protein related to thioredoxin[J]. Genomics,1997,39:331-339.

[15] 卫丽,黄晓书,李鹏坤,等.植物硫氧还蛋白研究进展[J].贵州农业科学,2006,34(6):129-131.

[16] GELHAYE E, ROUHIER N, NAVROT N, et al.The plant thioredoxin system[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(1):24-35.

[17] LAUGHNER B J, SEHNKE P C, FERL R J. A novel nuclear member of the thioredoxin superfamily[J].Plant Physiol,1998,118:987-996.

[18] KUROOKA H, KATO K, MINOGUCHI S,et al.Cloning and characterization of the nucleoredoxin gene that en-codes a novel nuclear protein related to thioredoxin[J]. Genomics,1997,39:331-339.

[19] 刘雷,尹钧.硫氧还蛋白的研究[J].东北农业大学学报,2003,34(2):219-225.

[20] JUTTNER J,OLDE D,LANGRIDGE P,et al.Cloning and expression of a distinct subclass of plant thiore-doxins[J]. Eur J Biochem,2000,267:7109-7117.

摘要[目的]探讨小麦TaNRX基因与抗旱的关系及其调控机制。[方法]根据晋麦TaNRX基因序列，设计一对特异引物，利用RT-PCR法从“平凉45号”冬小麦的cDNA中扩增出一个DNA片段，并克隆到pMD19-T载体，测序后比对分析。[结果]该片段具有完整的开放阅读框，长度为1 734 bp，编码577个氨基酸，与Genbank中晋麦的核酸序列具有100%的同源性，氨基酸序列中包含2个氧化还原二硫化物活性中心WCGPC和WCPPC，属于TRX家族，同时生物信息学分析发现该基因编码不稳定、非分泌、脂溶性蛋白。实时荧光定量PCR检测显示，该基因在“平凉45号”冬小麦各器官中均有表达，但具有不同的表达模式。[结论]为进一步深入研究TaNRX基因的功能及与其他基因之间的相互关系提供参考。

关键词小麦；TaNRX基因；克隆；实时荧光定量PCR

Cloning and Expression Analysis ofTaNRXGene of Winter Wheat about Pingliang No. 45 in Gansu Area

ZHU Zhan-dong1, LIU Xue-feng2, CHAI Shou-xi1*(1.College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou, Gansu 730070; 2.The Ist Pasturage Farm, Agricultural Division 14 of Xinjiang Production and Construction Corps, Hetian, Xinjiang 848306)

Abstract[Objective]To study the relationship between TaNRX gene and drought resistance of wheat. [Method] According to Jin wheat TaNRX gene sequence, a pair of specific primers was designed and a DNA fragment was amplified from the Pingliang 45 winter wheat using RT-PCR method, then it was cloned into pMD19-T vector, comparison and analysis was conducted after sequencing. [Result] The fragment has a complete open reading frame, 1 734 bp in length, encoding a protein of 577 amino acids. It has 100% homology with the Genbank nucleic acid sequence in Jin wheat, contains WCGPC and WCPPC. The cloning gene belonged to the TRX family, and the code is not stable, non secretion abd fat soluble protein. The gene was all expressed in different organs of Pingliang No. 45 of winter wheat, but with a different expression pattern by the real-time fluorescence quantitative PCR. [Conclusion] This study provides a reference to further study the relationship or function between TaNRX gene and other genes.

Key wordsWheat; TaNRX gene; Clone; Real time fluorescent quantitation PCR

收稿日期2015-04-30

通讯作者

作者简介朱占东(1985- )，男，甘肃会宁人，硕士研究生，研究方向：农学作物。*，教授，博士生导师，从事作物栽培学研究。

中图分类号S 512.1+1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)18-029-04